Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Техника лабораторной работы с фитопатогенными микроорганизмами. Учебное пособие
.pdf
241
ультрацентрифугирующие исследования позволили выделить пять групп
иммуноглобулинов (табл. 30.1):
1. IgG. Это основная фракция антител и содержит 80% иммуноглобулина
с молекулярной массой от 1 50 000 до 1 60 000; он содержит 2-4% углеводов и
демонстрирует самую низкую электрофоретическую подвижность среди всех
иммуноглобулинов. Это единственный иммуноглобулин, способный
проникать через плаценту.
2. ИгА. Этот иммуноглобулин имеет молекулярную массу от 1,80 000 до
4,00 000. Он имеет более высокое содержание углеводов (5-10%), чем IgG, IgA
находится в высоких концентрациях в крови, в выделениях, таких как
молозиво, слюна, слезы, а также в секрете бронхов и пищеварительных труб.
IgA не может пересечь плаценту.
3. IgM. Этот иммуноглобулин содержит больше всего белков, и его
аминокислотная последовательность еще не определена. Он содержит 576
аминокислот и имеет молекулярную массу 9,50,000. Это первое антитело,
синтезированное новорожденным животным или человеком. Клетки,
продуцирующие IgM, делятся на две дочерние клетки, которые продуцируют
IgG. IgMs может способствовать фагоцитозу микроорганизмов макрофагами и
полиморфными ядерными лейкоцитами. IGM не пересекают плаценту.
4. ИгД. Активность антител не приписывается IgDs; его роль в общей
схеме иммуноглобулина до сих пор неизвестна.
242
5. IgE. Он появляется в сыворотке крови в очень низких концентрациях;
его молекулярная масса составляет 1 90 000. Примерно у половины пациентов
с аллергическими заболеваниями наблюдаются высокие концентрации IgE.
Моноклональное антитело: Антитело, продуцируемое одним клоном
клеток или клеточной линией и состоящее из идентичных молекул антител.
Моноклональные антитела-это специфические антитела только к одному
антигенному детерминанту. Моноклональные антитела продуцируются
клонированными клетками (гибридомами), образующимися в результате
соединения В-лимфоцита с канцерогенной миеломной клеткой. Лимфоцит
наделяет моноклональное антитело способностью продуцировать антитела, а
миеломная клетка-способностью воспроизводить себя бесконечно. Поскольку
все клеточные клоны гибридомы происходят из одного В-лимфоцита, они
продуцируют специфические антитела только к одному антигенному
детерминанту.
Моноклональные антитела (mAb или muAb) - это моноспецифические
антитела, которые производятся идентичными иммунными клетками, которые
все являются клонами уникальной родительской клетки, в отличие от
поликлональных антител, которые производятся из нескольких различных
иммунных клеток.
Соединение антиген–антитело является нековалентным и необратимым
в нормальных лабораторных условиях и включает водородные связи, силы
Ван-дер-Ваальса, гидрофобные и кулоновские взаимодействия. Полученное
химическое вещество комплементарно аналогично тому, что находится между
ключом и замком.
Площадь соединения между антигеном и антителом составляет всего 1%
от общей поверхности глобулина, и ее специфичность зависит от
последовательности аминокислот, присутствующих в этой области. Степень
ассоциации между антигеном и антителом зависит от характеристик каждой
молекулы и определяется совокупными эффектами взаимодействий между
ними. Если аффинность и жадность высоки, молекулы будут соединяться
243
быстрее, а диссоциация будет очень медленной. Антисыворотки с сильными
реакциями осаждения проявляют большую жадность, чем те, которые слабо
реагируют при аналогичной степени разбавления.
Сродство антисыворотки зависит от температуры, при которой
происходит реакция. Более высокие температуры вызывают более сильные
реакции. Однако температура выше 40°C приводит к денатурации белка.
Концентрация соли также влияет на союз. Низкое содержание соли
способствует соединению реагирующих веществ.
рН может вызывать изменения сродства антиген–антитело и
концентрации реагирующих веществ для образования преципитатов.
Иммунизация и производство антител: Животные, обычно используемые
в производстве антисыворотки для исследовательских целей, включают
кроликов, морских свинок, мышей, коз, овец, обезьян, лошадей и кур. Выбор
вида зависит от наличия и объема необходимой антисыворотки. Механизм,
регулирующий синтез антител и реакции, происходящие в клетках иммунной
системы в присутствии вирусных частиц, чрезвычайно сложен, и некоторые
его характеристики до сих пор неизвестны.
Процесс иммунизации можно резюмировать следующим образом:
некоторые патогены, например бактерии/вирусы, попадающие в организм
животного, поглощаются клетками макрофагов. Некоторые из многих
миллионов хелперных Т-лимфоцитов, обычно циркулирующих в кровеносной
системе, активируются, чтобы идентифицировать нового врага, в данном
случае частицу патогена. Т - клетка активируется соединением с макрофагом,
который захватывает частицу. Объединение происходит, когда Т-лимфоцит
распознает в макрофаге один из своих собственных маркеров и другой,
соответствующий антигену. Активированный хелперный Т-лимфоцит
размножается сам и тем самым стимулирует размножение киллерных Т лимфоцитов и В-лимфоцитов.
244
Как только В-лимфоциты размножаются (примерно миллион различных
линий), Т-лимфоциты сигнализируют им о начале производства большого
количества антител, которые присоединятся к кровотоку.
Когда бактерия или вирус заражают животное или человека, некоторые
частицы проникают внутрь и начинают размножаться в инфицированных
клетках. Киллерные Т-лимфоциты вызывают химическое повреждение
мембран инфицированных клеток, тем самым прерывая репликацию вируса.
Некоторые из синтезированных антител нейтрализуют оставшиеся
вирусные частицы. Когда инфекция прекращается, супрессорный Т-лимфоцит
останавливает всю активность иммунной системы, предотвращая таким
образом неконтролируемые реакции.
Т-лимфоциты и В-лимфоциты памяти хранят информацию о вирусных
частицах и остаются в крови и лимфатической системе. Таким образом, они
готовы мобилизоваться и начать реакцию, если те же вирусные частицы снова
вторгнутся в животное.
Иммунизация может быть внутривенной, внутримышечной, подкожной,
внутрибрюшинной, внутрикожной, внутрисуставной или интранодулярной.
Это усиливает стимулирующее действие на иммунный ответ.
Выработка антител увеличивается в течение первых дней после первой
иммунизации, чтобы достичь максимальной концентрации, которая может
поддерживаться в течение нескольких дней. Если вводится новая доза
антигена, синтез антител быстро увеличивается до более высокой
концентрации, чем первоначально полученная первая доза антигена. Антитела
обнаруживаются в сыворотке крови иммунизированных животных. Это
называется сыворотка.
Чтобы получить антисыворотку, дайте образцу крови постоять, чтобы
отделить сыворотку от других компонентов крови. Сыворотку
центрифугируют (7840 г × 15 мин) для удаления остатков, которые еще не
отделились. Сыворотку можно хранить замороженной (от -20°С до -70°С) и
лиофилизированной или в виде жидкости при температуре 4°С, смешанной с
245
антисептиком. При надлежащем хранении антисыворотка может оставаться
активной в течение многих лет.
Иммунодиагностические методы используются для выявления
специфических бактериальных патогенов или близкородственных видов
бактериальных патогенов растений. Эти методы помогают идентифицировать
бактериальный род или вид, а также обнаружить скрытую инфекцию
бактериального патогена растений в здоровом посадочном материале.
Иммунодиагностические методы полезны при выявлении фитобактериальных
патогенов, имеющих карантинное значение для растений. Получение антител
через антигены и их применение являются существенной частью
иммунодиагностической техники.
30.1. Получение бактериальных антигенов или антигенного
гликопротеина из бактериальных патогенов
Способ получения антигенного гликопротеина для бактериального
патогена Xanthomonas corylina, инфицирующего растение noisetier.
Методика
Выращивают культуру Xanthomonas corylina на печеночно–пептонно–
глюкозо–агаровой среде (печеночный экстракт 5 г; пептон 5 г; глюкоза 5 г; агар
20 г; дистиллированная вода 1 л; рН 7) в течение 54 часов при температуре
26°С. Собирают рост с шести пластин, добавляя стерилизованную воду,
которую разводят до 1 л и центрифугируют при 19000 об / мин в течение ночи
в ультрацентрифуге при температуре 4°С. Супернатант фильтруют через
миллипоровую мембрану (размер пор 0,45 мкм) и осаждают сульфатом
аммония. Диализируйте осадок в проточной водопроводной воде в течение
ночи, а затем в дистиллированной воде на магнитной мешалке в течение трех
дней при температуре 4°C, часто меняя воду. Удаление сульфата аммония из
гликопротеина проверяется сульфатным тестом. Детоксифицируйте
гликопротеин (ГП), обрабатывая его горячей водой при температуре 90°С в
течение 15 минут. Белок оценивают по ГП по УФ поглощению при 280 нм по
следующей формуле:
246
Mg protein/ml =0:5 х OD х dilution/0:67
Приготовьте 1 мг ГП/мл в качестве антигена для инокуляции кроликам.
30.2. Иммунизация и получение антител
Этот метод демонстрирует получение и экстракцию иммуноглобулина
для бактерии Xanthomonas corylina.
Методика
Общий иммуноглобулин: Используйте двух кроликов для каждого
графика иммунизации. Кролики, отобранные для иммунизации, должны быть
одного возраста (4 месяца) и веса. Дают инъекцию ГП кролику (0,25 мг в
первый день, затем 0,5 мг на 2-й, 3-й, 4-й и 5-й дни соответственно, а затем 1
мг с интервалом в неделю) и собирают сыворотку крови через различные
промежутки времени, например, через 2, 3, 9 и 14 недель иммунизации методом
вакуумной пункции. Храните собранную сыворотку крови при комнатной
температуре в течение 2 часов, а затем при температуре 4°C в течение 24 часов.
Центрифугируйте сыворотку крови в гемолизированной пробирке при 4000 об
/ мин в течение 15 минут и соберите сыворотку. Оцените содержание
иммуноглобулинов в антисыворотке по поглощению УФ-излучения при 280
нм.
Иммуноглобулин “G”: Иммуноглобулин “G” экстрагируют из общего
иммуноглобулина по методу Бар–Джозефа и Гарнси с помощью адсорбции IgG
на белок-сефарозу с последующей десорбцией при низком рН. Оцените
содержание иммуноглобулина “G” в антисыворотке по УФ-поглощению при
280 нм.
30.2.1. Влияние периода иммунизации на восстановление
иммуноглобулина
Следуйте процессу иммунизации, как описано выше. Собирают
сыворотку после каждого графика иммунизации и оценивают содержание
иммуноглобулинов в антисыворотке по УФ-поглощению при 250 нм.
Содержание иммуноглобулинов в антисыворотке зависит от периода
иммунизации и, как установлено, увеличивается до периода 9 недель
247
иммунизации. Процентное увеличение иммуноглобулина в антисыворотке для
X. corylina составило 1,24, 12,36 и 8,66 при 3, 9 и 14 неделях иммунизации
сывороткой по сравнению с 2 неделями иммунизации сывороткой.
Иммуноглобулин увеличивается на 11,12% в антисыворотке в течение 3-9
недель иммунизации, тогда как он уменьшается на 3,70% в течение 9-14 недель
иммунизации. Разница в содержании иммуноглобулинов (мг)/мл
антисыворотки в течение 2-3, 3-9 и 9-14 недель иммунизации составила 0,44,
3,99 и 1,31 процента соответственно. Таким образом, увеличение продукции
иммуноглобулина было больше в течение 2-9 недель иммунизации, тогда как
оно уменьшалось в течение 9-14 недель иммунизации.
Установлено, что содержание иммуноглобулина “G” в антисыворотке
постоянно увеличивается до 14 недель иммунизации. Иммунизированная
сыворотка, полученная после 2, 3, 9 и 14 недель иммунизации, содержала 10,33,
12,99, 20,49 и 23,94 процента IgG соответственно. С другой стороны,
содержание IgM и других белков в антисыворотке варьировало от 89,67 до
76,06% и неизменно было связано с периодом иммунизации. Содержание IgM
и других белков в иммунизированной сыворотке снижалось по мере
увеличения периода иммунизации. Процентное увеличение IgG в
антисыворотке составило от 27,32 до 151,91, тогда как процентное снижение
IgM и других белков в антисыворотке составило от 0,37 до 7,83 в течение 14
недель иммунизации (процентные значения увеличения/уменьшения основаны
на 2-недельной иммунизации). Иммунная сыворотка, полученная слишком
рано после инъекции, имела преобладание низкоавидных IgM-антител, тогда
как более поздние кровотечения давали пропорционально более богатый и
полезный Ig. Содержание IgG в сыворотке крови постоянно увеличивалось с
увеличением периода иммунизации, хотя величина увеличения зависела от
периода иммунизации. Разница в содержании IgG (мг)/мл антисыворотки в
течение 2-3, 3-9 и 9-14 недель иммунизации составила 1,0, 3,50 и 1,06
соответственно. Установлено также, что колебания содержания IgM в
сыворотке крови зависят от периода иммунизации (Borkar, 1989b).
248
30.2.2. Влияние метода экстракции на извлечение и аффинность
иммуноглобулина
Извлечение иммуноглобулина из антисыворотки в основном
осуществляется для получения концентрированной формы (как при
солевосаждающем методе) или для выделения иммуноглобулина различной
молекулярной массы (как при ионообменной хроматографии).
Иммуноглобулин, будучи чувствительными белковыми молекулами, может
подвергаться воздействию химических веществ в процессе экстракции.
Методика
Экстракция иммуноглобулина: Антисыворотку (18 мл), полученную
через 2, 3, 9 и 14 недель иммунизации кролика (содержащую от 35 до 39 мг
белка/мл антисыворотки), которая зависела от иммунизации, следует
использовать отдельно для экстракции иммуноглобулина стандартными
методами солевого осаждения и ионообменной хроматографии.
1. Стандартное солевое осаждение иммуноглобулина из антисыворотки.
Приготовление насыщенной соли сульфата аммония: Растворить 766,80
г (NH4)2 SO4 в 1 л сверхчистой воды при перемешивании на магнитной
мешалке. Когда растворится лишь небольшое количество соли, нагрейте
раствор при температуре 50°C в течение 15 минут, чтобы растворить всю соль.
Отрегулируйте рН раствора до 7,0 с помощью аммиака или H2SO4 по мере
необходимости. Храните насыщенный солевой раствор в бутылке при
комнатной температуре.
Методика
Возьмите 5 мл антисыворотки в мензурку и добавьте по капле 5 мл
насыщенного сульфата аммония, помешивая на магнитной мешалке. Дайте
суспензии осесть в течение 30 минут на магнитной мешалке при
перемешивании. Осажденный раствор центрифугируют при 10000 об / мин в
течение 20 минут. Отбросьте супернатант. Растворите осадок в 1 мл
сверхчистой воды и добавьте по капле 1 мл раствора (NH4)2 SO4 при
перемешивании и дайте перемешаться в течение 30 минут. Центрифугируйте
249
раствор при 10000 об / мин в течение 20 минут и выбросьте супернатант.
Растворите осадок в 1 мл сверхчистой воды и добавьте по капле 1 мл раствора
(NH4)2 SO4 при перемешивании и дайте перемешаться в течение 15 минут.
Центрифугируйте суспензию при 10000 об / мин в течение 20 минут и
выбросьте супернатант. Растворите осадок в 0,5 мл сверхчистой воды.
Промыть центрифужную пробирку еще 0,5 мл воды и положить в диализный
мешок. Проводят диализ в течение 45 минут против сверхчистой воды, а затем
против физиологического буфера (Na2HPO4.12H2O, 32,926 г; K2HPO4, 1,088
г; Nacl, 80 г; сверхчистая вода, 1 л. Растворите ингредиент в небольшом объеме
воды и доведите его количество до 1 л. Храните его в морозильной камере в
качестве буфера запаса и используйте по мере необходимости. Разбавьте
исходный буфер из расчета 1:10 сверхчистой водой и отрегулируйте рН 7,2 при
каждом использовании. Во избежание загрязнения буфера добавляют азид
азота 0,1% в буфер или теомерсель в концентрации 0,0005) в течение 48 часов
при температуре 4°С на магнитной мешалке. Проверьте наличие сульфата
аммония. Центрифугируйте суспензию диализатора при 10000 об / мин в
течение 20 минут. Выбросьте поддон и отфильтруйте супернатант. Измерьте
OD на уровне 280 и рассчитайте белок/мл и храните в морозильной камере для
дальнейшего использования.
2. Выделение иммуноглобулина методом ионообменной хроматографии.
Буферы для ионообменной хроматографии:
Буфер I: Tris Hcl, 0,025 М; NaCl, 0,035 М
Добавьте 8,8 мл 0,1 Н HCl в 25 мл tris (0,2 М), чтобы получить tris HCl 0,025 М.
200 мл.
NaCl 0,035 М (т. е. 2,04 г/л) рН 8,8
Буфер I используется для элюирования IgG из сыворотки.
Буфер II: Tris HCl, 0,1 М; NaCl, 1 М
Раствор Трис 0,4 М (67,76 г в 1400 мл воды).
250
Смешайте 50 мл раствора трис с 50 мл HCl и 100 мл воды, чтобы получить трис
HCl 0,1 М буфера рН 8,8. Он используется для элюирования других молекул,
закрепленных в колонке.
Методика
Возьмите 90 мл DEAE tris acrylM и поместите в вакуумную колбу.
Удалите пузырьки воздуха из этой суспензии с помощью вакуумного насоса.
Это занимает около 15-20 минут. Вылейте суспензию DEAE в колонну (один
конец которой закрыт пробкой) до другого конца колонны и поставьте в
другую пробку. Соедините колонку с регулятором расхода с помощью
небольших пластиковых трубок. Отрегулируйте поток буфера,
присутствующего в DEAE, чтобы успокоить гель DEAE. Поместите буфер I в
буферный контейнер и прикрепите его с помощью небольших пластиковых
трубок к колонке геля через регулятор расхода для регулирования расхода
буфера в колонке геля (100 мл/час). Запустите оборудование и дайте буферу
стечь вниз по гелю в течение ночи, чтобы отрегулировать рН геля 8,8 рН.
Возьмите рН буфера, который вытекает из геля, и он должен быть точным 8,8
рН.
Извлеките сыворотку крови из диализного мешка и измерьте рН. Это
должно быть точное значение рН 8,8. Включите монитор поглощения до 1-2
часов использования. Поставьте лабораторный ток на 360 МА постоянного
тока. Отрегулируйте скорость на графике на миллиметровой бумаге. Он
составляет около 1,5 СМ/ЧАС. Установите диапазон поглощения на уровне 1,0.
Отрегулируйте базовую линию графической бумаги иглой с помощью
регулировки базовой линии, а также с помощью калибратора поглощения на
уровне 0,44 в качестве стандарта поглощения. Когда оборудование должно
работать, установите стандарт поглощения на 0. Для получения белка
необходимо использовать фильтр на 280 нм.
Поместите образец сыворотки в пробирку, соедините пробирку с
колонкой и буферным потоком запустите прибор. Наденьте пробоотборник и
отрегулируйте скорость на пробоотборнике (80 капель/трубка). Понаблюдайте
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]