Техника лабораторной работы с фитопатогенными микроорганизмами. Учебное пособие

Неспецифические ампликоны, не имеющие комплементарной области к последовательности захвата, такие как праймеры–димеры, не размножаются. Для обнаружения Ralstonia solanacearum в воде была разработана совместная методика ПЦР (Caruso et al., 2003).

АФЛП сочетает в себе рестрикционное пищеварение и ПЦР­амплификацию. Для начала геномная ДНК расщепляется двумя ферментами рестрикции—редким резаком, например EcoR1, и частым резаком, таким как Mse1. Адаптеры добавляются к концам фрагментов ДНК, чтобы обеспечить известные последовательности для ПЦР-амплификации. Эти адаптеры необходимы, потому что известных базовых последовательностей в конце ограниченных фрагментов недостаточно для проектирования праймеров. Короткие отрезки известных последовательностей добавляются к концам фрагмента с помощью ДНК-лигазы. Если затем провести ПЦР-амплификацию таких фрагментов, то все фрагменты будут амплифицированы, что будет трудно разрешить на одном геле. Поэтому праймеры сконструированы таким образом, что они включают в себя вышеупомянутые адаптерные последовательности плюс от 1 до 3 дополнительных пар оснований на их 3' ­концах. В таких случаях ПЦР-амплификация будет происходить только там, где праймеры способны отжигать до фрагментов, имеющих адаптерную последовательность плюс комплементарные пары оснований к дополнительным нуклеотидам. Дополнительные пары оснований называются селективными нуклеотидами. При использовании одного селективного нуклеотида амплифицируется больше фрагментов, чем при использовании двух или более. Обычно проводят два селективных раунда ПЦР. В первом раунде используется только один селективный нуклеотид, тогда как во втором раунде используется тот же самый селективный нуклеотид плюс один или два дополнительных нуклеотида. Для обнаружения амплифицированных фрагментов к одному из праймеров прикреплена радиоактивная или флуоресцентная метка. Затем амплифицированные продукты растворяются в секвенирующем геле и визуализируются с помощью авторадиографии или сканирования через специализированный флуоресцентный детектор.

Как правило, каждый рибосомный оперон является поликистоническим, состоящим из трех котранскрибированных генов, кодирующих структурные молекулы рРНК, 16S, 23S и 5S. Среди бактериальных видов средняя длина 16S, 23S и 5S структурных генов рРНК составляет 1522 бп, 2971 бп и 120 бп соответственно. Число копий, общие размеры рибосомных оперонов, последовательности генов и вторичные структуры трех генов рРНК высоко консервативны в пределах бактериального вида из-за их фундаментальной роли в синтезе полипептидов. Поскольку ген 16S рРНК является наиболее консервативным из трех генов рРНК, секвенирование гена 16S рРНК было установлено в качестве “золотого стандарта” для идентификации и таксономической классификации видов бактерий. Знание межвидового сохранения последовательности гена 16S рРНК и базовой структуры рибосомного оперона 16S-23S-5S привело Гриммонта и Гриммонта к первому пониманию его полезности при разработке типирования риб для бактериальной классификации.