Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Техника лабораторной работы с фитопатогенными микроорганизмами. Учебное пособие
.pdf
51
тестируют на гиперчувствительность и патогенность, работа продолжаеся с
патогенной культурой.
7.2. Отбор одиночных колоний и субкультур бактерий
Выбрав нужные колонии, их переносят на скошенный питательный агар.
Для этого бактериалогической петлей отбирают хорошо изолированную
колонию бактерий и проведят данной петлей по скосу агара в пробирке.
Посевы инкубируют при температуре 28±2°C в течение 48 часов для
получения достаточного количества бактериальной массы.
7.3. Проверка чистоты выделенной культуры
Культуры, полученные путем пересева одной колонии, проверяются на
чистоту. Для этого делают несколько разведений суспензии исследуемой
культуры в дистиллированной воде и наносят на чашки Петри с питательной
средой. Если культура чистая, то на среде развивается только один тип колоний
с оригинальной характеристикой. Чистые культуры бактерий сохраняются и
используются для дальнейших исследований.
52
8. ЭКСПРЕСС-ОЦЕНКА ПАТОГЕННОСТИ
БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИЗОЛЯТОВ
Как только бактерия выделена из пораженного растительного материала,
необходимо знать, является ли выделенная бактерия действительной причиной
заболевания и является ли она патогенной.
Определение патогенной природы выделенных бактерий на их
естественном хозяине обычно занимает 4-15 дней или даже больше, в
зависимости от типов симптомов, которые они вызывают на своем
естественном растении-хозяине; по сути, индукция симптомов замачивания
воды в естественных растениях-хозяевах требует 4-8 дней, индукция
симптомов увядания требует 8-15 дней, а индукция опухоли требует
приблизительно месяца или более.
В связи с этим важным аспектом является экспресс-метод оценки для
определения патогенной природы бактериальных изолятов.
Необходимый Материал
Бакпосев, табачная фабрика, баклажан растение, растение дурмана,
растений вигны, hypodermalsyringe, дистиллированной стерильной воды,
ярлык, инкубационный влажной камере, и так далее.
Процедура
Пожалуйста, смотрите следующее.
8.1. При гиперчувствительной реакции на табачное растение
Метод основан на том, что только растительные патогенные бактерии
способны индуцировать гиперчувствительную реакцию (HR) в табаке.
Сапрофитные бактерии не индуцируют HRs в табаке.
Разбавленную суспензию бактериальной культуры инокулируют
методом инъекционной инфильтрации в табачные листья с помощью шприца
для подкожных инъекций. Различные культуры могут быть привиты в разные
межжелудочковые срезы одного и того же табачного листа. Культуры, которые
являются патогенными для растений, производят быстрый некроз (HR) в
53
течение 24 часов. Иногда ЧСС вырабатывается уже через 8 часов (Borkar, 1982).
Тех изолятов, которые дает HR в растениях табака, несомненно
фитопатогенных бактерий или вирусов.
Если в изолирующих пластинах встречается несколько различных типов
колоний, то этот метод может быть использован для отбора патогенных. Этот
тест особенно полезен при дифференциации фитопатогенных ксантомонад и
псевдомонад от сапрофитных.
8.2. При гиперчувствительной реакции на растение, не являющееся
хозяином
Большинство патогенных бактерий растений вызывают
гиперчувствительные реакции потемнения на табачных растениях.
Однако в большинстве мест и лабораторий табачное растение может
быть недоступно. В таких случаях для проверки HR. Brinjal можно
использовать другие растения, не являющиеся хозяевами, или баклажаны, а
растение stramonium является наиболее подходящим для этой цели (Borkar,
1982).
Инокулят бактериальную суспензию (0,1 OD или 107 КОЕ/мл) в
дорсальную сторону листа исследуемого растения методом шприцевой
инфильтрации и выдерживают растение при температуре 28 ± 2°C с
влажностью воздуха более 85%.
Наблюдайте за реакцией HR, которая развивается в течение 18-24 часов
на листьях brinjal/stramonium.
8.3. По реакции бактерий на мягкие плоды
Реакция растительных патогенных бактерий, в частности Erwinia, на
мягкие плоды груши протекает очень быстро (Nagarale, 2010). Инокуляция
бактерий в плод груши вызывала мягкую гниль тканей и светло-темнокоричневую окраску гнилых тканей в течение 24 часов после бактериальной
инокуляции.
54
Инфильтрируйте бактериальную суспензию (0,2 мл) под кожицу плодов
груши или банана и инкубируйте при комнатной температуре (при 27°С).
Наблюдайте за развитием мягкой гнили в плодах из-за бактерии.
55
9. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПАТОГЕННОСТИ ВЫДЕЛЕННОЙ
БАКТЕРИАЛЬНОЙ КУЛЬТУРЫ НА ЕСТЕСТВЕННЫХ
РАСТЕНИЯХ-ХОЗЯЕВАХ
При тестировании бактериальной культуры на патогенность важно
использовать те же виды растений и сорта, из которых выделена бактериальная
культура. Для прививки следует отбирать молодые энергично растущие
растения или побеги. Желательно держать растения до и после прививки в
условиях повышенной влажности во влажной камере.
При проведении прививок любым методом следует поддерживать
контрольные/контрольные растения (обработанные так же, как и испытуемое
растение, но только стерильной водой). Сначала следует обработать
контрольные растения, а затем сделать прививку испытуемому растению. Это
позволяет избежать вероятности заражения и трудозатрат, связанных со
стерилизацией инструментов, используемых для прививки, что необходимо,
если испытуемое растение прививается первым.
Необходимый материал
Шприц для подкожных инъекций, хлопок, распылитель или пластиковый
распылитель, вакуумный насос, игла для рассечения, лезвие бритвы, порошок
карборандума, тестовая бактериальная суспензия, метки, инкубационная
камера влажности и так далее.
Методика
Приготовление бактериальных инокулятов для инокуляции на/в
растении: суспендировать 24-48-часовой рост молодых бактерий примерно в
25-30 мл стерильной воды. Эта бактериальная суспензия используется для
целей инокуляции в нужных частях растения. Следует использовать только
свежеприготовленную бактериальную суспензию.
Прививка может быть проведена различными методами в зависимости от
типов симптомов, которые будут получены.
56
9.1. Методом инфильтрации
Этот метод заключается во введении бактериальной суспензии в
межклеточные пространства листьев с помощью шприца для подкожных
инъекций 25-го калибра с иглой размером пять восьмых. Аккуратно вставьте
иглу для подкожных инъекций под эпидермис с дорсальной стороны листа.
Открытая сторона иглы должна быть обращена к листу. Введите необходимое
количество инокулята, чтобы ткань пропиталась водой. Этот метод также
может быть использован для инокуляции стебля и других частей растения.
Этот метод обычно используется для определения патогенности
бактериальных патогенов пятнистости листьев и листовой гнили. Этот метод
вызывает симптомы патогенности (реакцию замачивания воды) в течение
короткого периода времени (4-5 дней) по сравнению с другими методами
инокуляции для получения пятнистых болезней листьев. Способ подходит для
прививки листьев с грубой текстурой.
9.2. Методом инокуляции тампоном
Это лучшая альтернатива для распыления инокулята в случае частей
растения, обладающих высоким поверхностным натяжением или восковым
покрытием, которые не позволяют распыляемым инокулятам прилипать к
поверхности растения. Намажьте инокулят, смоченный в муслиновой ткани, на
поверхность части растения, подлежащей инокуляции. Инкубируйте растение
во влажной камере или опрыскивайте его водой три раза в день в течение
недели или до появления симптомов заболевания.
Метод инокуляции мазком обычно используется для определения
патогенности бактериальных патогенов пятнистости листьев и листовой гнили.
Этот метод более подходит для инокуляции листьев, которые имеют листовые
волоски или трихомы на поверхности растения.
9.3. Методом распыления инокуляции
При пятнистых, гнилостных и язвенных заболеваниях, при которых
возбудители обычно проникают в ткани через устьица, гидатоды или
чечевички, этот способ инокуляции является наиболее естественным.
57
Храните растения во влажной камере за 24 часа до прививки, чтобы
устьица могли раскрыться и создать высокую межклеточную влажность в
тканях вокруг естественных отверстий. Распылите бактериальную суспензию с
помощью ручного распылителя или пластикового распылителя, чтобы
тщательно покрыть поверхность растения. Поместите растение во влажную
камеру на 3 дня, а затем в естественные условия окружающей среды.
Опрыскивайте водой три раза в день в течение недели или до появления
симптомов заболевания.
Метод инокуляции распылением обычно используется для определения
патогенности бактериальной фитофтороза, дикого пожара яблони и груши, а
также заболеваний соцветий бактериального патогена или бактериальных
пятнистых заболеваний плодов.
9.4. Методом инокуляции погружением корней
Этот метод, вероятно, является наиболее естественным способом
инокуляции бактериальных патогенов, вызывающих сосудистое увядание.
Выкорчевать молодые всходы, промыть корни в воде, обрезать кончики
корней и погрузить в бактериальную суспензию на 10 минут. Пересадите
саженцы в почву и поливайте пересаженные саженцы соответствующим
образом. Наблюдайте за развитием симптомов увядания.
Этот метод обычно используется для определения патогенности
бактериального возбудителя увядания (Ralstonia) или в случае почвенных
бактериальных заболеваний.
9.5. Методом вакуумной инфильтрации
При этом способе бактериальная суспензия проталкивается через
устьица в межклеточные пространства. Он сокращает инкубационный период
для развития симптомов и лучше всего подходит для захватчиков устьиц.
Для получения правильного типа симптомов следует использовать очень
разбавленную бактериальную суспензию. При использовании
концентрированной суспензии могут возникнуть атипичные симптомы.
58
Способ заключается в нанесении инокулята с распылителем под
давлением 1,5 кг/см2 на нижнюю поверхность листа. Лист удерживается рукой
в нужном положении, а сопло распылителя находится примерно на расстоянии
2 дюймов. Давление получается путем подсоединения распылителя к
выпускному отверстию электромоторного насоса.
Метод вакуумной инфильтрации наиболее подходит там, где
поверхность листьев растений гладкая и восковая (например, банановый лист),
где инокуляты не удерживаются на поверхности листьев при нанесении
другими методами инокуляции.
9.6. Методом прививки булавочным уколом
Этот метод хорош для бактерий, вызывающих увядание, гниль, мягкую
гниль и галлы. Подготовьте пучок булавок, закрепив четыре - шесть тонких
булавок для насекомых на куске пробки. Только кончики булавок должны
выступать из пробкового куска. Если кусок пробки недоступен, можно
использовать диск моркови, чтобы сделать пучок булавочного укола.
Повредите часть растения, которую нужно привить пучком булавок, и нанесите
бактериальную суспензию на поврежденное место.
При болезнях лист прививают в центре, избегая среднего ребра. При
увядании прививают стебель в точке между семядолью и первым листом. Этот
метод плохо работает при многих болезнях пятнистости листьев.
Метод булавочного укола наиболее подходит для проверки патогенности
бактериальной гнили стебля, воротниковой гнили или возбудителя
корневищной гнили.
Инокулированные растения осматривают на предмет развития
симптомов не менее 1 месяца. При пятнистой или полосатой болезни листьев,
которая носит паренхиматозный характер, симптомы обычно развиваются в
течение 4-5 дней. Однако некоторые пятна на листьях, например, язва манго,
могут длиться до 10-15 дней. Увядание и гниль обычно занимают 7-10 дней, в
то время как галлы, Вызванные Agrobacterium tumefaciens, могут развиваться
более месяца.
59
При наблюдении за симптомами важно регистрировать и описывать
различные стадии развития симптомов, а не описывать конечную стадию.
Инокулированная бактерия считается истинным патогеном, если она
вызывает симптомы, сходные с теми, которые наблюдались на исходном
образце, из которого она была выделена. При типичных симптомах в
искусственно привитом растении происходят точно такие же изменения, как и
в природе, и развитие идет медленно. Восприимчивый сорт растения вызывает
типичные симптомы, в то время как резистентный сорт того же растения
вызывает атипичные симптомы. При атипичных симптомах происходит
быстрый (в течение 24 часов) некроз ткани в месте прививки без замачивания
водой на любой стадии. Эти атипичные симптомы возникают из-за
резистентности растений, высокой концентрации инокулята или неадекватных
методов бактериальной инокуляции, даже если бактерия может быть
патогенной.
60
10. ВЫДЕЛЕНИЕ И ПОДСЧЕТ МИКРООРГАНИЗМОВ,
АССОЦИИРОВАННЫХ С БАКТЕРИАЛЬНЫМ ПАТОГЕНОМ
РАСТЕНИЙ ИЗ ПОЧВЫ, РИЗОСФЕРЫ И ФИЛЛОПЛАНА
Микроорганизмы в изобилии и повсеместно присутствуют в нашей
окружающей среде. Они встречаются на филлоплане, на/в почве и ризосфере,
и некоторые из них обычно связаны с бактериальными патогенами растений,
вызывающими заболевания корневых систем или надземных частей растений.
К таким микроорганизмам относятся грибы, бактерии, актиномицеты, дрожжи
и т. д. Они оказывают либо синергетическое, либо антагонистическое
воздействие на бактериальные патогены растений или вызываемые ими
заболевания. Поэтому их выделение и перечисление является важным
аспектом в изучении бактериальных болезней растений. Ассоциированные
микроорганизмы должны быть выделены в чистом виде для изучения их
действия/взаимодействия.
Культура, содержащая один чистый вид клеток, называется чистой
культурой. Для выделения и изучения микроорганизмов в чистой культуре
применяется несколько различных методов. Для выделения используют
несколько сред (растворов, содержащих все питательные вещества,
необходимые для роста микроорганизмов).
10.1. Выделение микроорганизмов из культивируемой почвы/почв под
системами возделывания сельскохозяйственных культур
Хотя существуют различные методы выделения и подсчета
микроорганизмов (бактерий, грибов, актиномицетов, простейших, дрожжей и
водорослей) из почвы, метод последовательного разбавления агара или метод
подсчета жизнеспособных пластин является одной из наиболее часто
используемых процедур для выделения и подсчета грибов, бактерий, дрожжей
и актиномицетов, которые являются наиболее распространенными
микроорганизмами. Этот метод основан на принципе, что при
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]