Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Техника лабораторной работы с фитопатогенными микроорганизмами. Учебное пособие
.pdf
81
течение 30-60 секунд, промывается, высушивается и исследуется под
микроскопом.
Существует два вида процедур окрашивания, простые и
дифференциальные. Простые пятна используют один краситель (например,
метиленовый синий, кристаллический фиолетовый или карбофуксин), и клетки
и структуры внутри каждой клетки достигают цвета пятна. Дифференциальные
окраски требуют более одного красителя и различают структуры внутри клетки
или типы клеток, окрашивая их в разные цвета.
13.1. ПОДГОТОВКА БАКТЕРИАЛЬНЫХ МАЗКОВ
Наблюдения за микроорганизмами в живом состоянии являются
наиболее трудными и ограниченными. Когда световая микроскопия
используется для изучения морфологии бактерий, то есть размера, формы,
расположения и структуры для детального изучения клеток, наблюдения
внутренних клеточных компонентов и дифференцировки на определенные
группы, желательно, чтобы клетки сначала фиксировались (убивались), а затем
окрашивались, чтобы сделать их более заметными.
Бактериальные культуры выращивают либо на твердых (агаровых)
средах, либо в бульоне. Мазки (пленки) бактериальных культур получают
путем асептического переноса петли материала из бульонной культуры на
82
чистое предметное стекло. Для культур на агаровых средах организмы сначала
суспендируют, а эмульгированный материал раскладывают в тонкую пленку
на чистом стекле с помощью платиновой петли. Этот фильм называется
"мазок". Мазок высушивают на воздухе, а затем пропускают мазком вверх
через пламя два или три раза, чтобы нагреть закрепленные бактерии.
Термофиксация денатурирует бактериальные белки (или ферменты),
предотвращая аутолиз, а также усиливает прилипание бактерий к предметному
стеклу. Приготовленный таким образом мазок используется для
соответствующего окрашивания.
13.2. Простое или прямое окрашивание бактерий
При простом окрашивании клетки (мазок) окрашиваются путем
нанесения одного окрашивающего реагента. Целью простого метода
окрашивания является определение формы, размера и расположения
бактериальных клеток. Большинство бактерий имеют определенную форму,
которая попадает в одну из трех морфологических категорий: (1) сферический
(кокки, сингулярный коккус); (2) прямые палочки (бациллы, сингулярные
бациллы); и (3) спиралевидные или штопоровидные организмы (спириллы,
сингулярные спириллы [жесткие бактерии] или спирохеты [очень гибкие]).
Некоторые бактерии меняют свою форму и называются плеоморфными
(например, arthorobacter).
Простое окрашивание выполняется с использованием основных
красителей, которые имеют различное время экспозиции (например,
кристаллический фиолетовый-2-60 секунд; карбофуксин-15-30 секунд; и
метиленовый синий-15-120 секунд).
Необходимый материал
Двадцатичетырехчасовые культуры исследуемых бактерий,
окрашивающий раствор метиленового синего/кристаллического
фиолетового/карбофуксина, окрашивающий лоток, стеклянные предметные
стекла, прививочная петля, Бунзеновская горелка/спиртовая лампа,
промокательная бумага.
83
Методика
Возьмите чистые стеклянные предметные стекла, вымойте и высушите
их. Приготовьте бактериальные мазки всех бактериальных культур, как
описано в разделе 13.1. держите предметное стекло (термофиксированный
мазок) на лотке для окрашивания и нанесите около пяти капель пятна (любого
из вышеперечисленных) в течение указанного периода. Слейте пятно и
аккуратно промойте мазок медленно текущей водопроводной водой.
Промокните предметное стекло насухо промокательной бумагой (не
протирайте предметное стекло).
Осмотрите все препараты под масляно-иммерсионным объективом.
Сделайте рисунки для каждого бактериального организма. На основании
микроскопических наблюдений напишите описание бактерии как формы и
расположения клеток в каждой.
13.3. Отрицательное окрашивание бактерий
Отрицательное окрашивание обеспечивает самый простой и часто самый
быстрый способ получения информации о форме клеток, разрушении клеток и
ретрактильных включениях в клетках, таких как гранулы серы и Поли-βгидроксилбутирата, а также об эндоспорах.
Пятно, которое окрашивает фон и не окрашивает бактерии, называется
отрицательным пятном. В технике негативного окрашивания используется
простое пятно, то есть нигрозин или индийская краска (кислотное пятно).
Кислотное пятно легко отдает ион водорода, и хромофор красителя становится
отрицательно заряженным. Поскольку поверхность большинства
бактериальных клеток отрицательно заряжена, поверхность клетки
отталкивает пятно, и поэтому бактериальные клетки кажутся прозрачными и
незапятнанными при осмотре, тогда как фон окрашен.
Отрицательное окрашивание выгодно по двум причинам: (1) клетки
кажутся менее сморщенными или искаженными, потому что не происходит
84
фиксации тепла; и (2) капсулированные бактерии, которые трудно окрашивать,
можно наблюдать с помощью этого метода.
Необходимый материал
Двадцатичетырехчасовая культура исследуемой бактерии, раствор
нигрозина, чистые стеклянные предметные стекла, лоток для окрашивания,
прививочная петля, Бунзеновская горелка, папиросная бумага, микроскоп.
Методика
Поместите одну каплю нигрозина на один конец чистого стеклянного
предметного стекла. С помощью стерильной прививочной петли перенесите
полную петлю инокулятов из бульонной культуры в каплю пятна и аккуратно
перемешайте с петлей. При взятии инокулятов из агаровой среды получают
бактериальную суспензию. Смешайте каплю этой суспензии с нигрозином.
Возьмите еще одно чистое предметное стекло, поместите его против капли
взвешенной бактерии под углом 30° и дайте капле распространиться по краю
верхнего предметного стекла.
Распределите смесь окрашенных инокулятов в тонкий широкий мазок,
сдвинув верхний предметный предмет влево по всей поверхности нижнего
предметного предмета. Дайте мазку высохнуть на воздухе.
Исследуйте препарат под масляно-иммерсионным объективом.
Выберите лучшие микроскопические поля и сделайте рисунки нескольких
ячеек. Обратите внимание на форму, расположение и размер ячеек.
Особенности
Используемые культуры должны быть 24-часовыми. Всегда помещайте
маленькую каплю пятна близко к одному концу чистого слайда. Не
распространяйте каплю, смешивая ее с культурой. Толщина пленки должна
быть равномерной. Никогда не нагревайте фиксатор слайда. Отрицательно
окрашенные препараты не следует использовать для измерения длины и
ширины клеток.
85
13.4. Грамм окрашивания бактерий
Пятно Грама-это дифференциальное пятно, разработанное доктором
Гансом Кристианом Грамом, датским врачом, в 1884 году. Окрашивание
называется окрашиванием по грамму, в честь доктора Грэма. Это очень
полезное пятно для идентификации и классификации бактерий на две основные
группы: грамположительные и грамотрицательные.
В этом процессе фиксированный бактериальный мазок подвергают
воздействию четырех различных реагентов в указанном порядке:
кристаллического фиолетового (первичное окрашивание), раствора йода
(протравитель), спирта (обесцвечивающий агент) и сафранина
(противоокрашивающее средство). Бактерии, которые сохраняют первичное
пятно (кажется темно-синим или фиолетовым), называются
грамположительными, тогда как те, которые теряют кристаллический
фиолетовый цвет и получают встречное окрашивание сафранином, называются
грамотрицательными.
Различия в реакции окрашивания на окраску по Граму могут быть
связаны с химическими и физическими различиями в клеточных стенках
бактерий. Грамотрицательная клеточная стенка бактерий представляет собой
тонкую, сложную, многослойную структуру и содержит относительно высокое
содержание липидов, в дополнение к белку и мукопептидам.
Более высокое количество липидов легко растворяется спиртом, что
приводит к образованию больших пор в клеточной стенке, которые не
закрываются заметно при дегидратации белков клеточной стенки, тем самым
облегчая утечку кристаллического фиолетово–йодного комплекса (CV-I) и
приводя к обесцвечиванию бактерии, которая позже принимает контрпятна и
появляется Красной. Напротив, грамположительные клеточные стенки толстые
и химически простые, состоят в основном из белка и сшитых мукопептидов.
При обработке спиртом он вызывает обезвоживание и закрытие пор клеточной
стенки, тем самым не допуская потери комплекса CV-I, и поэтому клетки
остаются фиолетовыми.
86
Необходимый материал
Культуры тест-бактерий, возраст которых составляет 24 или менее часов,
грамм окрашивающих реагентов кристаллический фиолетовый, грамм йодного
раствора, 95-процентный этиловый спирт, сафранин, лоток для окрашивания,
промывочная бутылка дистиллированной воды, капельницы, прививочная
петля, стеклянные предметные стекла, промокательная бумага/абсорбирующая
бумага, папиросная бумага, Бунзенбернер/спиртовая лампа, микроскоп.
Методика
Сделайте тонкие мазки тест-бактерий на предметных стеклах. Дайте
мазкам высохнуть на воздухе. Тепло фиксирует мазки. Держите мазки с
помощью подставки для слайдов или прищепки для одежды. Покройте мазок
кристально-фиолетовым на 30 секунд. Промойте предметное стекло
дистиллированной водой в течение нескольких секунд с помощью
промывочной бутылки. Покройте мазок раствором йода грамма в течение 60
секунд. Раствор йода смыть 95 - процентным этиловым спиртом. Добавляйте
этиловый спирт капля за каплей, пока из мазка не исчезнет цвет.
(Грамположительные бактерии не затронуты, в то время как все
грамотрицательные бактерии полностью обесцвечены.) Промойте горки
дистиллированной водой и слейте воду. Нанесите сафранин на мазки в течение
30 секунд (контрасчет). Промойте дистиллированной водой и промокните
насухо впитывающей бумагой. Дайте окрашенным предметам высохнуть на
воздухе.
Рассматривать слайды под микроскопом с использованием масляной
иммерсии цели.
Те бактерии, которые кажутся фиолетовыми, называются
грамположительными; те, которые кажутся розовыми, описываются как
грамотрицательные.
Особенности
Всегда используйте свежие и молодые культуры (менее 24 часов), чтобы
избежать вводящих в заблуждение результатов. Во время тепловой фиксации
87
следует избегать чрезмерного нагрева. Следует избегать чрезмерной окраски
мазка. Мазки должны быть тонкими и однородными.
13.5. Кислотно-быстрое окрашивание бактерий
Кислотно-быстрое пятно-это дифференциальное пятно. Он был
разработан Паулем Эрилихом в 1882 году и позже модифицирован Францем
Цилем и Фридрихом Нильсеном. Он используется современными
микробиологами. Бактерии классифицируются как кислотоустойчивые, если
они сохраняют первичное пятно (карболфуксин) после промывки сильной
кислотой и кажутся красными, или как некислотоустойчивые, если они теряют
свой цвет при промывке кислотой и окрашиваются метиленовым синим.
Свойство кислотостойкости, по-видимому, связано с наличием в
клеточной стенке высокого содержания липида, называемого миколовой
кислотой, что чрезвычайно затрудняет проникновение пятен. В кислотобыстрой процедуре бактериальный мазок обрабатывают карбофуксином с
последующей термофиксацией и обработкой кислым спиртом и метиленовым
синим.
Процедура кислотно-быстрого окрашивания полезна для идентификации
членов микобактерий, особенно при окрашивании мокроты, у которых есть
микобактерия туберкулеза, причина туберкулеза, потому что эта палочка
является единственным кислото-быстрым организмом, обычно
встречающимся в мокроте. M. smegmatis является непатогенным, но
нормальным обитателем гениталий и может быть ошибочно принята за M.
tuberculosis в моче.
Необходимый материал
Питательный агар наклонные или бульонные культуры тест-бактерий,
кислотостойкие окрашивающие реагенты, карболфуксин, кислотно–спиртовой
(3% HCI + 95% спирт), метиленовый синий, окрашивающая стойка, горячая
плита/водяная баня, стеклянные предметные стекла, Бунзеновская горелка,
инокулирующая петля, промокательная бумага/абсорбирующая бумага,
папиросная бумага, микроскоп.
88
Методика
Приготовьте мазки исследуемой бактерии на предметных стеклах.
Воздух сухой и тепло фиксируют мазки. Заливают мазки карболфуксином.
Нагрейте горки до кипения в течение 3-5 минут. Время от времени добавляйте
больше пятен, чтобы предотвратить высыхание мазков. Остудить горки и
промыть дистиллированной водой. Обесцвечивайте мазок кислотой–спиртом в
течение 10-30 секунд или до тех пор, пока мазок не приобретет слабый розовый
цвет. Промыть горки дистиллированной водой. Контрамарку смазывают
метиленовым синим в течение 1-2 минут. Промыть дистиллированной водой.
Промокните насухо промокательной бумагой.
Исследуйте мазки под масляно-иммерсионным объективом и запишите
цвет тестируемых организмов, чтобы классифицировать их как кислотобыстрые или некислото-быстрые.
Особенности
Не позволяйте пятну карболфуксина испариться и высохнуть; при
необходимости добавьте еще одно пятно. Предотвратите закипание пятна
карболфуксина. Следует избегать чрезмерной окраски мазка.
13.6. Окрашивание бактериальной клеточной стенки
Все настоящие бактерии обладают жесткой клеточной стенкой.
Клеточная стенка-это структура, которая непосредственно окружает
клеточную мембрану. Бактерия, из которой полностью удалена стенка (обычно
путем ферментативного переваривания), называется протопластом. Фермент
лизоцим избирательно растворяет клеточную стенку грамположительных
бактерий. Химический состав клеточной стенки может варьировать у
различных видов бактерий, так как целлюлоза, гемицеллюлозы и хитин
являются основными компонентами. Кроме того, пептидогликан (также
известный как муреин и мукопептид), вещество, встречающееся только у
прокариот, также присутствует. Пептидогликан-это огромная молекула,
89
состоящая из аминокислот и сахаров (пептид, аминокислота + гликань, сахар).
Возможно, клеточная стенка также дифференциально проницаема. Клеточную
стенку можно визуализировать специальными методами.
Необходимый материал
Двадцатичетырехчасовой скос питательного агара тестируемой
бактерии, водный раствор Конго красного, ацетилпиридиния хлорида (0,34%),
раствор метиленового синего Леффлера, прозрачное стекло предметного
стекла, капельница, прививочная петля, горелка Бунзена.
Методика
Приготовьте мазок исследуемой бактериальной культуры. Жаром
зафиксируйте мазок. Нанесите три капли ацетилпиридиния хлорида и одну
каплю Конго красного. Смешайте со стеклянной палочкой в течение 5 минут.
Залейте мазок красным Конго. Промойте предметное стекло
дистиллированной водой. Дайте мазку высохнуть на воздухе. Встречное пятно
с метиленовым синим цветом. Промыть дистиллированной водой. Промокните
насухо предметное стекло.
Исследуйте микроскопически с помощью масляно-иммерсионного
объектива.
Клеточная стенка окрашивается в красный цвет, а цитоплазма-в синий.
13.7. Окрашивание цитоплазматических мембран
Самый внешний слой цитоплазмы называется цитоплазматической
мембраной. Толщина этого слоя составляет 75 Å (Ангстрем) (7,5 нм или 0,0075
мкм) единиц. Цитоплазматическая мембрана у бактерий представляет собой
фосфолипид–белковый бислой, подобный тому, который присутствует в
эукариотических клетках. Основное отличие состоит в том, что в
цитоплазматических мембранах большинства прокариот отсутствуют стерины.
Серьезные нарушения в мембране приводят к выходу цитоплазмы из клетки и
гибели организма. Метод плазмолиза используется для отделения клеточной
стенки от цитоплазмы, а затем мембрана окрашивается.
90
Необходимый материал
Культура бацилл, раствор нитрата калия, фиксирующий раствор Буина,
раствор Виктории голубой, предметное стекло, прививочная петля, горелка
Бунзена.
Методика
Приготовьте мазок бактерии на чистом предметном стекле. Жаром
зафиксируйте мазок. Погрузите предметное стекло в раствор нитрата калия на
15 минут для проведения плазмолиза. Держите предметное стекло в
фиксирующем растворе Буина в течение 15 минут. Промойте предметное
стекло в водопроводной воде. Нанесите раствор Виктория Блю на 3 секунды.
Промойте предметное стекло в водопроводной воде. Промокните сухой мазок.
Исследуйте препарат микроскопически под масляно-иммерсионным
объективом.
Цитоплазматическая мембрана выглядит как темно-синий внешний слой,
покрывающий сжатое, неправильной формы тело, цитоплазму.
13.8. Окрашивание бактериальных спор (эндоспор)
Некоторые бактерии способны образовывать или превращаться в спящие
структуры в неблагоприятных условиях; эти структуры метаболически
неактивны и не растут и не размножаются, если благоприятная среда не
возвращается. Так как эти структуры формируются внутри клеток,
следовательно, они называются эндоспорами. Немецкий ботаник Фердинанд
Кон (1828-1898) открыл существование эндоспор у бактерий. Они удивительно
устойчивы к воздействию тепла, радиации, химических веществ и других
веществ, которые обычно смертельны для организма. Термостойкость спор
была связана с их высоким содержанием кальция и дипиколиновой кислоты.
Одна бактерия образует одну спору в процессе, называемом
спорообразованием.
Спорообразование происходит либо при истощении необходимого
питательного вещества, либо при неблагоприятных условиях окружающей
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]