Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Техника лабораторной работы с фитопатогенными микроорганизмами. Учебное пособие
.pdf
11
31. ИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ С ПОМОЩЬЮ МОЛЕКУЛЯРНЫХ
МЕТОДОВ ............................................................................................................ 279
31.1. Выделение бактериальной ДНК ........................................................... 280
31.2. Методы, основанные на профилировании плазмид ........................... 284
31.3. Методы, основанные на гибридизации ................................................ 290
31.4. Методика на основе ПЦР ...................................................................... 301
31.5. Методы комбинированной гибридизации и ПЦР ............................... 317
31.6. Методы на основе рРНК/ДНК .............................................................. 320
31.7. Метод терминального рестрикционного фрагмента паттерна (TRFP)
........................................................................................................................... 324
31.8. Метод импульсного полевого гель-электрофореза (PFGE) ............... 325
31.9. Анализ на основе гуанина и цитозина ................................................. 327
31.10. Проточная цитометрия для бактериальной диагностики ................ 330
31.11. Содержание дезоксирибонуклеиновой кислоты в бактерии, ее связь с
вирулентностью и лекарственной устойчивостью ...................................... 332
32. БАКТЕРИОФАГИ ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ РАСТЕНИЙ ................ 334
32.1. Выделение литических фагов ............................................................... 335
32.2. Типирование бактериальных фагов ..................................................... 338
32.3. Определение титра фага ........................................................................ 338
32.4. Выделение лизогенных фагов ............................................................... 339
32.5. Сохранение бактериофагов ................................................................... 340
33. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ БАКТЕРИЙ К
АНТИБИОТИКАМ И ПЕСТИЦИДАМ ............................................................ 342
33.1. Определение чувствительности бактерий методом отравленной пищи
........................................................................................................................... 342
33.2. Определение чувствительности бактерий методом дискового анализа
........................................................................................................................... 343
12
33.3. Определение минимальной ингибирующей концентрации (мик)
антибиотиков/пестицидов .............................................................................. 343
33.4. Выделение устойчивых к антибиотикам/пестицидам мутантов бактерий
........................................................................................................................... 344
33.5. Исследования перекрестной устойчивости бактерий к пестицидам 345
33.6. Исследования множественной лекарственной устойчивости бактерий
........................................................................................................................... 345
33.7. Исследования патогенности бактерий с множественной лекарственной
устойчивостью ................................................................................................. 346
33.8. Лечение бактериального мутанта от устойчивости к антибиотикам 347
33.9. Лечение устойчивости к антибиотикам, переносимым плазмидами 348
34. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МУТАЦИИ В БАКТЕРИАЛЬНОМ ПАТОГЕНЕ
РАСТЕНИЙ .......................................................................................................... 349
34.1. Выделение мутанта, устойчивого к антибиотикам, методом
градиентной пластины .................................................................................... 350
34.2. Выделение авирулентных мутантов (мутация по характеру
патогенности) ................................................................................................... 352
34.3. Выделение мутанта-альбиноса (мутация для пигментации) ............. 354
34.4. Дифференциация вирулентного и авирулентного мутанта ............... 354
35. ПЕРЕНОС ГЕНЕТИЧЕСКОГО ФАКТОРА В ПАТОГЕННЫЕ БАКТЕРИИ
РАСТЕНИЙ .......................................................................................................... 356
35.1. Передача генетического материала путем трансформации ............... 356
35.2. Передача генетического материала путем конъюгации ..................... 358
35.3. Передача генетического материала посредством трансдукции ........ 361
36. ПОПУЛЯЦИОННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ
РАСТЕНИЙ НА/В РАСТЕНИИ-ХОЗЯИНЕ ..................................................... 363
36.1. Оценка бактериальной популяции методом промывки листьев ....... 363
36.2. Оценка популяции эпифитов методом отпечатков листьев .............. 364
13
36.3. Оценка эндофитной популяции методом последовательного разведения
........................................................................................................................... 364
36.4. Динамика численности бактерий в растении-хозяине ....................... 365
36.5. Выделение межклеточной жидкости для изучения роста бактерий . 366
37. СОХРАНЕНИЕ ОБРАЗЦОВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ..... 367
37.1. Сухая консервация образцов ................................................................. 367
37.2. Способ микроволновой сушки .............................................................. 367
37.3. Сохранение образцов в консервирующих растворах ......................... 368
37.4. Сохранение образцов пятнистости/гнили листьев путем ламинирования
........................................................................................................................... 369
37.5. Сохранение образцов фруктов путем обработки воском ................... 369
38. ИЗМЕРЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ РАСТЕНИЙ .................... 370
38.1. Глоссарий для описания симптомов .................................................... 370
38.2. Измерение пятнистости листьев/болезней, вызываемых гнилью ..... 371
39. ВЫДЕЛЕНИЕ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО СОЕДИНЕНИЯ ................... 373
39.1. Метод предварительной оценки для определения наличия
антибактериального соединения в растении путем вычисления
бактериальной популяции .............................................................................. 373
39.2. Оценка антибактериальных свойств растений .................................... 374
39.3. Эффективность водного экстракта лекарственного растения против
патогенных бактерий растений (Xanthomonas spp.) .................................... 375
39.4. Приготовление экстракта растений в растворителях ......................... 376
39.5. Оценка и количественное определение эквивалентного
антибактериального соединения в растительном экстракте-растворителе376
39.6. Выделение антибактериального соединения из растительного
источника.......................................................................................................... 377
39.7. Выделение антибактериального соединения из микробного источника
........................................................................................................................... 378
39.8. Тестирование эффективности антибактериальной молекулы ........... 379
14
39.9. Идентификация антибактериальной молекулы .................................. 380
40. ВЫДЕЛЕНИЕ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ МИКРОБОВ .......................... 382
40.1. Выделение антибактериальных грибов ............................................... 382
40.2. Выделение антибактериальных бактерий ............................................ 383
40.3. Тестирование антибактериальных свойств микробной культуры .... 384
40.4. Массовое производство антибактериальной культуры ...................... 385
41. ПРИГОТОВЛЕНИЕ БАКТЕРИЦИДНЫХ СОСТАВОВ ........................... 387
41.1. Приготовление бактерицидного спрея ................................................. 387
41.2. Приготовление бактерицидных паст .................................................... 388
15
1. ТЕХНИКА БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ РАБОТЕ С
ФИТОПАТОГЕННЫМИ МИКРООРГАНИЗМАМИ
Для проведения научных экспериментов необходима
специализированная научно-исследовательская лаборатория. Научноисследовательская лаборатория представляет собой хорошо оборудованное
помещение с необходимой лабораторной посудой, реактивами и рабочими
площадями. Для бактериологической лаборатории обязательно необходимо
соблюдение асептических условий при работе с патогенными бактериями
растений. С целью поддержания лабораторных стандартов, в
бактериологической лаборатории требуется соблюдение определенных правил
и этики во время работы.
1.1. Правила работы в бактериологической лаборатории
В лаборатории должна регулярно поддерживаться чистота.
1. Лаборатория должна быть чистой, особое внимание обращается на
наличие пыли, для чего регулярно осуществляется уборка помещения.
2. Все инструменты должны находиться на своих местах.
3. Все химические реактивы, бутылки, пакеты, расходники должны
находиться на своих местах.
4. Недопускается употребление еды и питья в лаборатории.
5. При работе в лаборатории обязательно наличие спецодежды (халаты,
чепчики, маски и т.д.).
6. Спецодежда хранится в отдельных шкафах, отведенных для этого.
7. Регулярно должна осуществляться дезинфекция лаборатории от
насекомых и вредителей.
8. Отходы хранятся в мешках для утилизации и утилизируются
ежедневно.
9. В лаборатории не допускается шуметь.
16
10. Используйте лабораторию только для экспериментов и исследований,
а не для общих целей.
11. Избегайте дискуссий, лекций и сплетен в лаборатории.
12. Для хранения реактивов, рабочей стеклянной посуды, колб и пипеток
отводится отдельное место в шкафу, предназначенном для них.
13. Образцы для исследования хранятся (не более 48 часов) в хорошо
запечатанных пакетах в шкафу, выделенном для этой цели.
14. Оборудуются отдельные места для хранения игл, щипцов, ножниц,
резинок и других предметов в одном месте.
15. Фильтровальная бумага хранится в одном сухом месте.
Поддержание гигиены в лаборатории
1. Не оставляйте открытыми чашки Петри с микробной культурой.
2. Отходы сразу помещаются в одноразовын пакеты, предназначенные
для этого в надлежащем месте; одноразовый пакет не следует держать
открытым.
3. Ежедневно осуществляется уборка лаборатории с использованием
моющих средств. Рабочие столы протираются соответствующими
противомикробными средствами или метилированным спиртом. Необходимо
регулярно вытирать пыль с приборов.
1.2. Лабораторные инструменты
Необходимо регулярно проверять правильность работы приборов перед
использованием в экспериментальных целях, чтобы избежать потери важного
материала для исследований. Для каждого прибора ведется журнал
регистрации. После использования необходимо проводить очистку прибора.
Основное оборудование
1. Ламинарный шкаф с воздушным потоком
Один из важнейших инструментов в лаборатории. Он необходим для
работы с микроорганизмами в асептических условиях. Ламинарный шкаф с
воздушным потоком используется для выделения микробов, бактериальных
17
патогенов растений, их переноса, подготовки питательных сред и для всех
других целей, где требуются асептические условия при микробиологической
работе.
2. Термостаты (инкубаторы)
Используются для роста и размножения микроорганизмов.
Пробирки/чашки Петри с посевами инкубируются при требуемых
температурах в термостатах (инкубаторах) для облегчения роста микробов.
3. Холодильник
Применяется для хранения микробных культур, термочувствительных
химических веществ, лекарств, антигенов, антител и прочего. Они также могут
быть использованы в исключительных случаях для временного хранения
неиспользуемых чашек Петри и пробирок с затвердевшими средами.
4. Сухожаровые шкафы
Используются для стерилизации стеклянной посуды при более высоких
температурах и сушки образцов при залданных температурах.
5. Дистилляторы
Дистиллированная стерильная вода необходима во всех
микробиологических работах, при приготовлении культуральных сред,
приготовлении химических растворов, водных заготовок и т. д.
6. Автоклавы
Применяются для стерилизации рабочих сред, стеклянной посуды, а в
некоторых случаях почвенного материала, одноразового микробиологического
материала и всех других материалов, которые не деградируют/не портятся во
время паровой стерилизации.
7. Микроскопы
Используются для идентификации микробов, их клеточных структур и
размеров, а также для просмотра внутреннего клеточного материала.
Прикладное оборудование
1. Спектрофотометр, УФ-спектрофотометр или спектроник
18
Применяется для измерения количества различных биохимических
материалов растений и микробов на основе поглощения на определенной длине
волны.
2. Ультрацентрифуга
Используется для отделения биологических компонентов бактериальных
клеток, разделения тканей растений, и так далее.
3. Газовая хроматография масс спектроскопия
Применяется для идентификации биохимического материала и его
органической формы.
4. Устройство для электрофореза
Применяется для разделения макромолекул, таких как ДНК, РНК и
белки. Фрагменты ДНК разделяются в зависимости от их размера.
5. Оборудование для ИФА
Диагностический инструмент для обнаружения патогенов в образцах
растений с помощью твердофазного иммуноферментного анализа.
6. Оборудование для ПЦР
Чаще всего используется для амплификации сегментов ДНК с помощью
полимеразной цепной реакции.
7. УФ-трансиллюминатор
Используется для идентификации флуоресценции, исходящей от
бактериальных культур (Например для определения флуоресценции бактерий
рода Pseudomonas).
8. Лиофилизатор
Используется для получения бактериальной культуры в
лиофилизованном (обезвоженном порошкообразном виде) с целью
длительного хранения и консервирования.
9. Камеры для выращивания растений
Применяются для инкубации саженцев, инокулированных патогенным
материалом при соответствующей температуре, влажности и интенсивности
света с целью развития симптомов заболевания.
19
Вспомогательное оборудование
1. Лабораторные нагревательные плиты
Используются для нагрева жидкого материала.
2. Вортексы
Позволяют смешать суспензию среды/бульона в пробирке.
3. Миксеры
Применяются для получения жидкой пасты из растительных образцов
или смешивания экспериментального материала.
4. Водяная баня
Используется для нагрева жидкого материала при определенной
температуре или для испарения биологического материала.
5. Вакуумный испаритель
Применяется для испарения биологического материала с целью
получения его в остаточном виде или в виде порошка.
6. pH-метр
Используется для измерения и регулировки рН сред, буферов и
биологических материалов.
7. Шейкер
Используется для перемешивания инокулированных сред для роста
микроорганизмов.
1.3. Общие прниципы работы в лаборатории
1. Агрессивные химические вещества и растворители должны храниться
в отдельных местах. Помещение для хранения должно быть чистым и сухим,
не должно быть влаги. Суспензии, выделяющие пары, следует использовать в
вытяжном шкафу.
2. Закрывайте все водопроводные краны, когда они не используются.
Проверяйте все электрические кнопки и отключите их при выходе из
лаборатории.
3. Перед уходом очистите лабораторию и рабочие столы.
20
4. Храните аптечку первой помощи в лаборатории и используйте ее в
случае несчастных случаев.
5. Лаборатория должна быть оборудована огнетушителем, который будет
использоваться в случае незначительных чрезвычайных ситуаций пожара.
6. На видном месте должны быть отражены номера телефонов для
следующих служб: заведующий лабораторией, медицинская служба, пожарная
служба и полиция.
7. О любых повреждениях приборов, разбитых банках с реактивами и
поломках следует сообщать ответственным лицам.
8. Не перегружайте автоклав и печи сверх предписанного времени.
Обращайтесь с ними в соответствии с предписаниями и указаниями по
применению.
9. В микробиологической работе используйте только сверхчистую воду
или дистиллированную стерильную воду.
10. Записывайте результаты своих наблюдения в журнал исследований.
11. Планируйте свой эксперимент заранее, чтобы иметь время для
закупки материалов, необходимых в эксперименте.
12. Подготовьте питательные среды в необходимых количествах, чтобы
избежать отходов и высыхания этих материалов. Используйте химикаты
разумно и только в необходимых количествах.
13. Держите бутыли и банки с реактивами и растворителями плотно
закрытыми.
14. Держите мыло, жидкое мыло и полотенца или салфетку рядом с
умывальником.
15. Мойка стеклянной посуды и использованных чашек Петри
осуществляется в специально отведенном месте вне исследовательской
лаборатории.
16. Старайтесь проводить опыты в нескольких повторностях для
получения достоверных результатов.
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]