Файловый архив студентов. Файловый архив студентов.
1327 вузов, 5487 предметов.
/ Регистрация
FAQ Обратная связь Вопросы и предложения
Добавил:
asman00000@mail.ru Работаю на МРТ, учусь на стоматолога,делитесь со мной файлами в ТГ ozzii05 Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Медицинский Университет "РЕАВИЗ"
Предмет:
Биология
Файл:
Тейлор, Грин, Стаут 1 том [2013].pdf
Скачиваний:
0
Добавлен:
05.09.2026
Размер:
28 Мб
Скачать
☆
►Содержание►
150 Глава 3
ДНК
См. табл. 5.5.
3.15. Как можно определить концентрацию аскорбиновой кислоты в полученной пробе?
3.16. Вам даны три раствора сахара: в одном содержится глюкоза, в другом — смесь глюкозы и сахарозы, в третьем — сахароза.
а) Как вы определите, какой сахар
содержится в каждом из этих растворов?
б) Кратко опишите дальнейшие процедуры,
с помощью которых можно подтвердить правильность вашего ответа (допустим, что в вашем распоряжении имеется нужный прибор и что время позволяет провести такие определения).
3.17. Как можно приготовить 100 мл 10%-ного раствора глюкозы?
3.18. В вашем распоряжении имеются в качестве исходных растворов 10%-ный раствор глюкозы и 2%-ный раствор сахарозы. Как можно приготовить из них 100 мл смеси с конечной концентрацией 1% сахарозы и 1% глюкозы?
Опыт 3.2. Определение биомолекул в тканях
Биохимику часто приходится выявлять при сутствие тех или иных биомолекул или опре делять их количество в живых тканях, т. е. ве сти качественный или количественный ана лиз. Иногда эти определения можно выпол нять непосредственно на самой ткани, но не редко им должен предшествовать тот или иной процесс экстракции или очистки.
Полезно потренироваться на какихлибо обычных пищевых продуктах или на расти тельном материале, определяя в них те био молекулы, о которых шла речь в опыте 3.1. Там, где это возможно, мы предлагаем проце дуру экстрагирования, которая позволит ис пользовать для анализа чистый бесцветный раствор. Усвоив смысл таких процедур, сту дент сможет при необходимости сам предло жить аналогичные методики.
Материалы и оборудование
Все, что перечислено в опыте 3.1 (от начала и до раство ра ДХФИФ) Ступка с пестиком Микроскоп Предметные и покровные стекла Лезвие бритвы Часовое стекло Раствор Шульца Флороглюцин + концентрированная соляная кислота Клубень картофеля Яблоко Вата Одревесневший стебель Семена/орехи Намоченный горох Бобы
Микроскопическое исследование тонких срезов ткани
Метод пригоден для знакомства с теми отложе ниями запасных веществ, которые можно видеть под микроскопом, например с крахмальными зернами в клубне картофеля.
Микроскопическое исследование срезов с соответствующим окрашиванием или какой-либо иной химической обработкой
Метод пригоден для выявления перечисленных ниже веществ.
Редуцирующие сахара. Поместить срез в не сколько капель реактива Бенедикта и осто рожно нагреть до кипения; при необходимо сти добавить воды, чтобы предотвратить вы сыхание.
Крахмал. Поместить в разбавленный раствор
/KI.
I
2
Белок. Поместить срез в несколько капель ре актива Миллона и осторожно нагреть до ки пения; при необходимости добавить воды, чтобы предотвратить высыхание.
Масла и жиры. Окрасить исследуемый мате риал, например семена, суданом III, после че го промыть водой и(или) 70%ным спиртом. Приготовить срезы и заключить в соответст вующую среду.
Целлюлоза, лигнин и т. п. См. табл. 5.5.
Химические компоненты живого 151
Исследование прозрачных водных растворов
Обесцветить ткань, если в этом есть необходи мость. Присутствующие в ткани пигменты могут
мешать цветным реакциям, но обычно эти пиг менты легко удалить из ткани органическими растворителями, например 80%ным этанолом или 80%ным пропаноном (ацетоном) (беречь от соприкосновения с открытым огнем). Следует, од нако, помнить, что эти растворители могут уда лять из ткани липиды и растворимые сахара. Ме тодика пригодна для извлечения хлорофилла из листьев.
Гомогенизация материала. Сахара и белки. Ку
сочки предназначенного для исследования мате риала растереть в кашицу с небольшим количе ством воды при помощи ступки или миксера. Растертый материал процедить через несколько слоев тонкой кисеи или нейлона, предваритель но смоченных водой, и либо отфильтровать, ли бо отцентрифугировать для удаления твердых частиц. Это может и не потребоваться, если сус пензия окажется высокодисперсной и практиче ски бесцветной. Прозрачный раствор анализи руют как обычно, а если нужно, приготовляют из него соответствующие разведения. Твердый оса
док, если он представляет интерес, также может быть подвергнут анализу.
Липиды. Растереть материал, перенести в про бирку и вскипятить. Липиды отделяются в виде капелек масла. Провести окрашивание суданом III. Можно вместо этого приготовить эмульсию из тонко наструганного ядра ореха или других пищевых продуктов (которые могут быть и окра шенными) и провести эмульсионную пробу.
Описанная методика пригодна для выявления в различных материалах указанных ниже ве ществ.
Фрукты (например, (витамин С, сахара) яблоки или апельсины) Орехи (масла) Семена клещевины (масло) Семена гороха (белок) Семена сосны (белок, масло) Картофель (крахмал, витамин С) Яйца (белок)
Исследуемые материалы можно подразде лить на фракции и затем каждую такую фрак цию, например семена, мякоть плодов, кожуру или сок, исследовать по отдельности.
4
4

ФЕРМЕНТЫ

ерменты можно определить как биологи ческие катализаторы. Катализатором на
Ф
но само в реакции не изменяющееся. Поскольку ферменты представляют собой белковые моле кулы, синтезируемые в живой клетке, их называ ют биологическими катализаторами. В любой клетке человеческого тела содержатся тысячи ферментов. Они катализируют многочисленные химические реакции, протекающие здесь при температурах, совместимых с жизнью, т. е. в пре делах от 5 до 40 °C. Чтобы эти реакции с той же скоростью осуществлялись вне организма, по требовались бы высокие температуры и резкие изменения некоторых других условий, что было бы для клетки губительным. Ферменты абсолют но необходимы, поскольку без них реакции в клетке протекали бы слишком медленно и не могли бы поддерживать жизнь.
рует данный фермент, называют субстратом этого фермента. Соединяясь с субстратом, фермент образует короткоживущий ферментсубстрат ный комплекс. В таком комплексе шансы на то, что реакция произойдет, значительно возраста ют. По завершении реакции ферментсубстрат ный комплекс распадается на продукт (или про дукты) и фермент. Фермент в реакции не изменя ется и по ее окончании может снова взаимодей ствовать с новой молекулой субстрата:
Субстрат + Фермент Фермент Комплекс
зывают вещество, ускоряющее реакцию,
Вещество, превращения которого катализи
(S) (E) субстратный фермент–
комплекс (ES) продукт (EP)
Фермент + Продукт (P)
(Е) (продукты)
или:
E + S ES EP E + P
Анаболизм и катаболизм
Совокупность всех химических реакций, проте кающих в клетке, составляет то, что мы называ ем метаболизмом. Метаболизм подразделяется на анаболизм и катаболизм — два разных типа реак ций, которые нередко протекают и в разных час тях клетки. Катаболические реакции, или реакции распада, обычно сопровождаются высвобожде нием энергии. По большей части это окисление и гидролиз. Анаболические реакции, или реакции синтеза, наоборот, требуют затрат энергии. Часто это реакции конденсации. Все эти реакции про текают с участием ферментов. Примером фер мента, участвующего в анаболизме, может слу жить глутаминсинтетаза, катализирующая син тез аминокислоты глутамина из глутаминовой кислоты и аммиака:
Глутаминовая + Аммиак + АТФ Глутамин +
кислота
+ Вода + АДФ + Ф
(АТФ — аденозинтрифосфат; АДФ — аденозин дифосфат; Ф честве примера фермента, участвующего в ката болизме, можно назвать мальтазу:
Крахмал + Вода Мальтоза
н
— неорганический фосфат). В ка
н
Глутаминсинтетаза
Мальтаза
Метаболические пути
Обычно данное исходное вещество превраща ется в продукт (или продукты) через ряд про
Ферменты 153
межуточных соединений, в образовании кото рых принимают участие несколько фермен тов, действующих последовательно один за другим. Такая последовательность реакций составляет так называемый метаболический путь. В клетке работает одновременно много метаболических путей. Реакции протекают со гласованно, подчиняясь строгой регуляции, что объясняется специфической природой ферментов. Один фермент обычно катализи рует только одну реакцию. Таким образом, ферменты служат для регулирования происхо дящих в клетке реакций и обеспечивают над лежащую их скорость.

4.1. Свойства ферментов

Ферменты характеризуются следующими основ ными свойствами.
1. Все они представляют собой глобулярные белки.
2. Информация о них, как и о других белках, закодирована в ДНК.
3. Ферменты действуют как катализаторы (см. выше).
4. Их присутствие не влияет ни на природу, ни на свойства конечного продукта (или продуктов) реакции.
5. Ферменты действуют чрезвычайно эф фективно, т. е. очень малое количество фермента вызывает превращение боль ших количеств субстрата. Одна молеку ла каталазы способна, например, при температуре тела разложить за одну се кунду на воду и кислород около 600 ты сяч молекул пероксида водорода. Мож но сравнить эффективность каталазы и такого, например, неорганического ка тализатора, как диоксид марганца, доба вив их по отдельности к пероксиду водо рода и измерив скорость выделения кис лорода. (Хорошим источником каталазы служит печень). В среднем ферменты способны катализировать около 1000 реакций в секунду. Без катализаторов реакции протекали бы в миллионы раз медленнее.
6. Ферменты высокоспецифичны, т. е. один фермент катализирует обычно только од ну реакцию. Каталаза, например, катали
зирует только расщепление пероксида во дорода.
7. Катализируемая ферментом реакция об ратима.
8. Активность ферментов меняется в зависи мости от pH и температуры, а также от концентрации как субстрата, так и самого фермента (об этих факторах мы будем го ворить в разд. 4.3).
9. Ферменты снижают энергию активации катализируемой реакции (разд. 4.1.1).
10. В молекуле фермента есть активный центр, который вступает в контакт с суб стратом. Этот активный центр имеет осо бую форму (разд. 4.1.2).
4.1.1. Энергия активации
Представим себе смесь бензина и кислорода. Реакция между этими двумя веществами с тер модинамической точки зрения возможна, но она не пойдет без затраты некоторого количе
А
Б
Рис. 4.1. А. Энергия активации для катализируемой и некатализируемой реакции. Б. Аналогичная ситу ация — когда валун скатывается с холма, высво бождается больше энергии, чем было затрачено на то, чтобы поднять его на холм и заставить ска титься.
154 Глава 4
ства энергии, поступившей, например, в фор ме простой искры. Так же обстоит дело и со спичкой. Содержащиеся в спичечной головке вещества могут вступить в реакцию, суммар ным итогом которой будет выделение энергии, но чтобы запустить реакцию, придется сначала затратить небольшое количество энергии (до статочно тепловой энергии, выделяющейся, когда мы чиркаем спичкой о коробок). Энер гия, необходимая для того, чтобы заставить ве щества вступить в реакцию, называется энер гией активации. Ферменты, действуя как ката лизаторы, снижают энергию активации (рис. 4.1). Они повышают общую скорость ре акции, не изменяя в скольконибудь значи тельной степени температуру, при которой эта реакция протекает.
4.1.2. Механизм действия ферментов
Ферменты обладают очень высокой специ фичностью. Фишер (Fischer) в 1890 г. выска зал предположение, что эта специфичность обусловливается особой формой молекулы фермента, точно соответствующей форме мо лекулы субстрата (или субстратов). Эту гипо тезу часто называют гипотезой «ключа и зам ка»: субстрат сравнивается в ней с «ключом», который точно подходит по форме к «замку», т. е. к ферменту. В схематическом виде это представлено на рис. 4.2. Часть молекулы фермента, вступающую в контакт с субстра том, называют активным центром фермента, и именно активный центр фермента имеет осо бую форму.
Молекулы большей части ферментов во мно го раз крупнее, чем молекулы тех субстратов, ко торые атакует данный фермент. Активный же центр фермента составляет лишь очень неболь шую часть его молекулы, обычно от 3 до 12 ами нокислотных остатков. Роль остальных амино кислот, составляющих основную массу фермен та, заключается в том, чтобы обеспечить его молекуле правильную глобулярную форму, кото рая, как мы увидим далее, очень важна для наи более эффективной работы активного центра фермента.
Образовавшиеся продукты по форме уже не соответствуют активному центру фермента. Они отделяются от него (поступают в окружающую среду), после чего освободившийся активный центр может принимать новые молекулы суб страта.
Рис. 4.2. А. Схема, иллюстрирующая гипотезу «клю ча и замка», предложенную Фишером для объяснения действия ферментов. Б. Более детальное схемати ческое изображение ферментсубстратного комп лекса. Аминокислотные остатки, образующие ак тивный центр фермента, пронумерованы в соот ветствии с их положением в первичной структуре фермента.
Ферменты 155
Рис. 4.3. Схемы, иллюстрирующие кошландовскую гипотезу индуцированного соответствия. А. Простая схема, поясняющая механизм действия. Фермент в результате присоединения субстрата к активному центру слегка изменяет форму, и соответственно становится более объемным. Б. Более подробная схема. Соединяясь с ферментом, субстрат вызывает в нем изменение, в результате которого активные группы фермента сближаются. (По J. C. Marsden, C. F. Stoneman (1977), Enzymes and equilibria, Heinemann Educational Books.)
В 1959 г. Кошланд (Koshland) предложил новую интерпретацию гипотезы «ключа и зам ка», получившую название гипотезы «индуциро ванного соответствия». На основе данных, по зволяющих считать ферменты и их активные центры физически более гибкими, чем это ка залось вначале, он заключил, что субстрат, со единяясь с ферментом, вызывает какието из менения в структуре его активного центра. Аминокислотные остатки, составляющие ак тивный центр фермента, принимают опреде ленную форму, которая дает возможность фер
нять свою функцию (рис. 4.3). Подходящей аналогией в этом случае может служить пер чатка, которая при надевании на руку соответ ствующим образом изменяет свою форму. По мере выяснения отдельных деталей механизма различных реакций в эту гипотезу вносятся уточнения.
Представление о том, как работает фермент, можно получить с помощью рентгеноструктур ного анализа и компьютерного моделирования. Рис. 4.4 иллюстрирует это на примере фермента лизоцима.
менту наиболее эффективным образом выпол
156 Глава 4
А Б В
Г
Рис. 4.4. Созданные на компьютере модели третичной структуры лизоцима до и после присоединения субстрата, показывающие, как работает этот фермент. А. Вид сбоку. Активный центр имеет форму щели, проходящей по всей толще молекулы. Б. Вид сбоку. Активный центр с находящейся в нем молекулой субстрата. Обратите внима ние на некоторое изменение формы фермента, вызванное присоединением субстрата. Это пример «индуцирован ного соответствия», постулированного Кошландом в 1959 г. Субстрат лизоцима представляет собой короткую олигосахаридную цепь, легко умещающуюся в активном центре и расщепляемую ферментом. Такие олигосахариды входят в состав бактериальных клеточных стенок и их разрушение влечет за собой гибель бактерий — клеточные стенки утрачивают присущую им жесткость и клетки лопаются под действием осмотических сил. Лизоцим — широко распространенный фермент, выполняющий защитную функцию; он содержится в слезах, слюне и в слизи носовой полости. В. Вид спереди. Активный центр с находящейся в нем молекулой субстрата. Г. Компьютерная модель лизоцима с субстратом в активном центре.

4.2. Скорость ферментативных реакций

Мерой скорости ферментативных реакций слу жит количество субстрата, подвергшегося пре вращению в единицу времени, или количество образовавшегося продукта.
Ферменты 157
Рис. 4.6. Зависимость скорости ферментативной ре акции от концентрации фермента.
Рис. 4.5. Скорость ферментативной реакции.
Скорость определяют по углу наклона каса тельной к кривой на начальной стадии (а на рис. 4.5) реакции. Чем круче наклон, тем больше скорость. Со временем скорость реакции обыч но снижается, по большей части в результате снижения концентрации субстрата (см. след. разд.).
4.3. Факторы, влияющие
на скорость ферментативных реакций
Для изучения влияния какоголибо фактора на скорость реакции все прочие факторы дол жны оставаться неизменными и по возможно сти иметь оптимальное значение. Измерять сле дует только начальные скорости, как указано выше.
4.3.1. Концентрация фермента
При высокой концентрации субстрата и при по стоянстве других факторов, таких, например, как температура и pH, скорость ферментативной реакции пропорциональна концентрации фер мента (рис. 4.6). Катализ осуществляется всегда в условиях, когда концентрация фермента гораздо ниже концентрации субстрата. Поэтому с возра станием концентрации фермента растет и ско рость ферментативной реакции.
4.3.2. Концентрация субстрата
При данной концентрации фермента скорость ферментативной реакции возрастает с увеличе нием концентрации субстрата (рис. 4.7). Теоре тическая максимальная скорость реакции V никогда не достигается, но наступает момент, когда дальнейшее увеличение концентрации субстрата уже не влечет за собой скольконибудь заметного изменения скорости реакции. Это следует объяснить тем, что при высоких концен трациях субстрата активные центры молекул фермента в любой данный момент оказываются практически насыщенными. Таким образом,
Рис. 4.7. Зависимость скорости ферментативной ре акции от концентрации субстрата.
max
158 Глава 4
сколько бы ни было в наличии избыточного суб страта, он может соединиться с ферментом лишь после того, как образовавшийся ранее фермент субстратный комплекс диссоциирует на продукт и свободный фермент.
4.3.3. Температура
С повышением температуры ускоряется движе ние молекул, вследствие чего у молекул субстра та и фермента оказывается больше шансов стол кнуться друг с другом. В результате увеличивает ся и вероятность того, что реакция произойдет. Температура, обеспечивающая максимальную активность, называется оптимальной температу рой. Если температура поднимается выше этого уровня, скорость ферментативной реакции сни жается, несмотря на увеличение частоты столк новений. Происходит это вследствие разруше ния вторичной и третичной структур фермента, иными словами, вследствие того, что фермент претерпевает денатурацию (рис. 4.8). Молекула фермента развертывается и его активный центр постепенно утрачивает присущую ему форму. Наиболее чувствительны к воздействию высо кой температуры водородные связи и гидрофоб ные взаимодействия.
Температурный оптимум для большинства ферментов млекопитающих лежит в пределах 37–40 °C. Существуют, однако, ферменты с бо лее высоким температурным оптимумом; у бак терий, живущих в горячих источниках, он может, например, превышать 70 °C. Именно такие фер
Рис. 4.9. Ход ферментативной реакции при разных температурах.
менты используются в качестве добавок к сти ральным порошкам для стирки в горячей воде. Когда температура приближается к точке замер зания или оказывается ниже ее, ферменты инак тивируются, но денатурации при этом не происхо дит. С повышением температуры их каталитиче ская активность вновь восстанавливается.
В наше время для длительного хранения пи щевых продуктов широко используют такой способ, как быстрое их замораживание. Оно предотвращает рост и размножение микроорга низмов, а также инактивирует их пищеваритель ные ферменты, так что они оказываются уже не в состоянии вызвать разложение пищевых про дуктов. Инактивируются также и ферменты, находящиеся в самих пищевых продуктах. Замо роженные продукты необходимо хранить при низких температурах, не допуская их размора живания. Последнее следует делать непосредст венно перед приготовлением пищи.
Рис. 4.8. Зависимость скорости ферментативной ре акции от температуры.
4.1. Ознакомьтесь с рис. 4.9. Что вы можете сказать по поводу формы трех кривых, описывающих ход ферментативной реакции при разных температурах?
Температурный коэффициент Q
Влияние температуры на скорость ферментатив ной реакции может быть выражено через темпе ратурный коэффициент Q
10
:
10
Ферменты 159
Скорость реакции при (x + 10) °C
Q10=
Скорость реакции при x °C
В пределах от 0–40 °C Q10ферментативной реакции равен 2. Иными словами, при каждом повышении температуры на 10 °C скорость реак ции удваивается.
4.3.4. pH
При постоянной температуре любой фермент, как правило, работает наиболее эффективно в узких пределах pH. Оптимальным считается то значение pH, при котором реакция протекает с максимальной скоростью (рис. 4.10 и табл. 4.1).
Рис. 4.10. Зависимость скорости ферментативной ре акции от pH.
При более высоких и более низких pH актив ность фермента снижается. С понижением pH возрастает кислотность и увеличивается концен трация H но, количество положительных зарядов в среде. Сдвиг pH меняет заряд ионизированных кислот ных и основных групп, что ведет к разрушению ионных связей, участвующих в поддержании специфичной формы молекул фермента (разд.
3.5.3). В результате изменяется форма молекул фермента и в первую очередь форма его активно
+
ионов. Увеличивается, следователь
го центра. При слишком резких сдвигах pH фер мент денатурирует.
4.2. а) Укажите оптимальное значение pH для активности фермента B на рис. 4.11.
б) Назовите в качестве примера какие-либо
известные вам ферменты, активность которых могла бы характеризоваться
1) кривой А и 2) кривой В.
в) Почему активность фермента С снижается
между pH 8 и 9?
г) Почему регуляция активности
ферментов путем изменения pH важна in vivo?
д) К раствору пероксида водорода
добавляли при разных значениях pH по 1 мл раствора каталазы и отмечали время, за которое удавалось собрать 10 мл O
. При этом были получены
2
следующие результаты:
pH раствора Время сбора газа,
4
,00 20,00 5,00 12,50 6,00 10,00 7,00 13,60 8,00 17,40
мин
Представьте эти результаты в виде графика и объясните их.
Таблица 4.1. Оптимум pH для некоторых фермен­тов
Фермент Оптимум pH
Пепсин Сахараза 4,50 Энтерокиназа 5,50 Амилаза слюны 4,80 Каталаза 7,60 Химотрипсин 7,00–8,00 Липаза поджелудочной железы 9,00 Аргиназа 9,70
1
1
Содержится в желудке вместе с соляной кислотой.
2,00
Рис. 4.11. Влияние pH на активность трех фермен тов — А, В и С.
Соседние файлы в предмете Биология
Помощь Обратная связь Вопросы и предложения Пользовательское соглашение Политика конфиденциальности