Вопрос 4. Антитела (иммуноглобулины).

Антитела – это особый класс белков, называемых иммуноглобулинами, которые вырабатываются под влиянием антигенов и обладают способностью специфически реагировать с ними.

Антитела могут нейтрализовать токсины бактерий (их называют антитоксины) или вирусы (вируснейтрализующие), осаждать растворимые антигены (преципитины), склеивать корпускулярные антигены (агглютинины), лизировать бактерии (лизины).

Вопрос 5. Структура иммуноглобулинов. Свойства иммуноглобулинов.

Структура антител:

Электронно-микроскопическоеисследование показало, что молекула иммуноглобулина имеет форму буквыYс меняющимся углом между двумя верхними отрезками. Молекула состоит из 4-х полипептидных цепей двух типов: Н-цепей (тяжелых) с молекулярной массой 50000-55000 иL-цепей (легких) с молекулярной массой 20000-25000. Цепи соединены между собойS-S-связями (дисульфидными). Каждая белковая цепь имеетNH₂–конец, который является вариабельным в зависимости от антигена, вызвавшего образование антитела, и СООН-конец – имеет одинаковую последовательность аминокислот и является константным.

Молекулярное строение антител. Каждая легкая цепь состоит из двух доменов (глобул), образованных последовательностями по 110 аминокислот (один вариабельный и один – константный). Тяжелая цепь состоит из 4-5 доменов (1 – вариабельный и 3-4 – константных).

Вопрос 6. Классы и типы иммуноглобулинов.

Различают 5 классов иммуноглобулинов: IgM,IgG,IgA,IgD,IgE.Из нихIgG,IgD,IgE– мономеры,IgM– пентамер,IgAможет быть мономером, димером и тримером. Такие димеры и тримеры называются секреторными.

IgG	IgM	IgA	Секреторный IgA	IgD	IgE
мономер	пентамер	мономер	димер	мономер	мономер

Свойства иммуноглобулинов.

Антитела, вызывающие видимые реакции, называются полными. Антитела, реагирующие лишь одним центром, видимых реакций не дают и называются неполными. В этом случае антитела блокируют антиген и часто связывают комплемент, поэтому их называют комплементсвязывающими антителами.

Тема 8: Реакции иммунитета, их практическое значение. Реакции агглютинации, преципитации, их виды и применение; реакции гемолиза и связывания комплемента. Иммунобиологические препараты.

Вопросы для самоподготовки:

1. Реакции агглютинации, их виды.

2. Реакции преципитации, их виды.

3. Реакция гемолиза. Постановка реакции гемолиза.

4. Реакция связывания комплемента (РСК). Постановка РСК.

5. Вакцины: классификация, применение.

6. Сыворотки и иммуноглобулины.

Теоретический материал для самоподготовки:

Вопрос 1 . Реакция агглютинации и ее варианты

Реакция агглютинации (РА)– склеивание целых микробных клеток (агглютиногенов) гомологичными антителами (агглютининами) в присутствии электролитов (хлорида натрия). В результате образуются хорошо видимые хлопья агглютината, который выпадает в растворе в виде осадка.

Рис. 1. Схема реакции агглютинации (РА): а) с IgM-антителами, б) с IgG- антителами.

В зависимости от целей исследования существуют различные модификации постановки РА:

1. Для идентификации чистой культуры микроорганизмов, выделенной из материала, взятого от больного, используют реакции агглютинации на стекле или в пробирках. Антитела для этих реакций содержатся в диагностических агглютинирующих сыворотках, полученных путем иммунизации кроликов определенными видами бактерий.

Реакция агглютинации на стекле (ориентировочная РА) применяется для определения вида микроорганизма. Она ставится на предметных стеклах. Для этого на обезжиренное стекло пипеткой наносят несколько капель сывороток в небольших разведениях (1:10 – 1:20) и каплю изотонического раствора хлорида натрия для контроля. Затем в каждую каплю сыворотки и в контрольную каплю вносят петлю суточной культуры бактерий, выросших на плотной питательной среде. Внесенную культуру тщательно перемешивают до получения суспензии.

Рис.2. Реакция агглютинации на стекле

Реакция происходит при комнатной температуре в течение 2-5 минут. Образовавшийся осадок можно увидеть невооруженным глазом, иногда используют лупу (х5). При положительной реакции в капле с сывороткой появляются хлопья, хорошо различимые на темном фоне при покачивании предметного стекла. При отрицательной реакции жидкость остается равномерно мутной, как в контроле (рис.2).

Кроме специфической агглютинации бактерий, вызванной антителами, возможна спонтанная агглютинация(происходит в отсутствие иммунной сыворотки), которую даютR-формы бактерий, не образующие гомогенной взвеси в изотоническом растворе хлорида натрия и осаждающиеся в виде клеточных агрегатов.

При кислой реакции среды в результате снятия одноименного заряда с поверхности бактериальных клеток в изоэлектрической зоне также происходит склеивание бактерий – кислотная агглютинация. Чтобы исключить возможность учета ложноположительных результатов спонтанной агглютинации, всегда ставят контрольную пробу с хлоридом натрия.

Развернутая реакция агглютинации ставится при положительном результате, полученном в ориентировочной реакции агглютинации.

В пробирках готовят увеличивающиеся разведения агглютинирующей сыворотки в хлориде натрия, к которым добавляют по 2-3 капли взвеси возбудителя в хлориде натрия. Параллельно с опытом ставят 2 контроля: контроль сыворотки (сыворотка, разведенная хлоридом натрия) – для исключения образования осадка белками сыворотки из-за их денатурации при нагревании, и контроль культуры (взвесь микробов в хлориде натрия) – для исключения спонтанной агглютинации. Пробирки энергично встряхивают и помещают в термостат при 37° на 2 ч, а затем оставляют при комнатной температуре на 18-20 ч.

Агглютинацию учитывают по количеству осадка и степени просветления жидкости (рис.3).

Рис. 3. Развернутая реакция агглютинации

Реакцию начинают учитывать с контрольных пробирок: в контроле сыворотки содержимое пробирки должно быть прозрачным, в контроле культуры – равномерно мутным, без осадка.

В опытных пробирках интенсивность реакции агглютинации отмечают следующими знаками: ++++ - полная агглютинация (хорошо выраженные хлопья агглютината в абсолютно прозрачной жидкости), +++ - неполная агглютинация (хлопья агглютината в слабоопалесцирующей жидкости), ++ - частичная агглютинация (хлопья четко различимы, жидкость слегка мутная), + - слабая, сомнительная агглютинация (жидкость очень мутная, хлопья в ней плохо различимы), – – отсутствие агглютинации (жидкость равномерно мутная как в контроле культуры).

Реакцию считают положительной, если агглютинация отмечается в разведении, близком к титру диагностической сыворотки.

2. Для обнаружения антител в сыворотке крови больноготакже применяют развернутую реакцию агглютинации.

Для проведения реакции у взрослого берут 3-5 мл крови из локтевой вены, а у маленьких детей 1 мл из пятки. Кровь помещают в термостат при 37° на 10-15 мин. После свертывания крови сгусток отслаивают от стенок пробирок стеклянной палочкой и выдерживают при 4° в течение часа для более полного отделения сыворотки. Сыворотку затем разводят хлоридом натрия от 1/50 до 1/1600.

В качестве антигена в этой реакции используется диагностикум, который готовят из взвеси заведомо известных убитых бактерий, а иногда и живых микроорганизмов.

Все ингредиенты разливают по пробиркам или лункам планшета как в предыдущем случае, энергично встряхивают и помещают на 2 часа в термостат при 37°. Через 2 ч учитывают предварительный результат реакции (агглютинация с Н-антигеном). Затем штатив оставляют при комнатной температуре на 18-20 ч, после чего окончательно учитывают результаты (агглютинация с О-антигеном).

Количество антител выражают в титре.За титр принимают разведение в последней пробирке, где поставили ++.Реакцию считают положительной, если агглютинация отмечается в разведении, близком к титру, указанному на этикетке диагностикума.