4.3.5. Реализация митогенного сигнала

Циклические реакции. Имеется два семейства белков, «дви­жущих» клеточный цикл: циклин(сусНп)-зависимые се-рин/треониновые протеинкиназы (Cdk, cyclin-dependent ki­nases) и сами циклины. Циклины регулируют активность Cdk и тем самым контролируют способность последних модифи­цировать клеточные мишени, непосредственно участвующие в метаморфозах цикла. Cdk активны только в комплексе с одним из циклинов. Поэтому сборка и активация многочис­ленных комплексов Cdk-cyclin, а также их диссоциация — ключевые моменты клеточного цикла (рис. 4.10).

Как следует из их названия, циклины синтезируются и распадаются в строго определенные моменты цикла, разные для разных циклинов. Имеется три основных класса: Gl-цик-лины, необходимые для прохождения G1/S, S-циклины — для прохождения S-фазы и Ст2-циклины (или митотические) —

для вхождения в митоз. В клетках млекопитающих имеется также несколько семейств Cdk, участвующих в различных ре­гуляторных событиях. Исчезновение циклина из внутрикле­точной среды в определенный момент столь же важно, как и его появление (устранение циклинов из внутриклеточной среды достигается как их деградацией, так и блоком синтеза). Например, в митозе (на границе метафазы и анафазы) один из циклинов быстро деградирует в результате протеолиза; если же этого не происходит, то митоз не может завершиться и разде­ления дочерних клеток не происходит.

Первоначально в цитоплазме ооцитов Xenopus был обнару­жен фактор MPF (maturation promoting factor), который ока­зался способным индуцировать специфические для митоза процессы — в частности, дезинтеграцию ядерной мембраны, конденсацию хроматина, формирование веретена и ряд дру­гих. После его очистки оказалось, что MPF состоит из Cdk, названной Cdc2 (она же p34^cdc2), в комплексе с митотическим циклином (cyclin В).

Активация Cdk, необходимой для вхождения клеток в митоз, требует не только ее ассоциации с циклином, но и двух допол­нительных модификаций — фосфорилирования треонина в по­ложении 161 и, напротив, дефосфорилирования тирозина 15. Эти реакции осуществляются специфическими ферментами (киназами и фосфатазами), образующими дополнительные

уровни контроля. Так, киназа, активирующая Cdk, фосфорили-рует треонин 161, чего, однако, оказывается недостаточно из-за присутствия ингибирующего фосфотирозина 15 (степень фос­форилирования последнего определяется балансом активностей Cdc2 — специфической тирозинкиназы weel и конкурирующей с ней фосфатазы Cdc25 — высокоспецифичной и в свою очередь находящейся под строгим контролем).

После образования cyclin-Cdc2 weel фосфорилирует тиро­зин 15, инактивируя комплекс. Затем происходит активирующее фосфорилирование треонина 161 и, наконец, дефосфорилиро-вание тирозина 15 ферментом Cdc25, что обеспечивает полную, необходимую для вхождения в митоз активность Cdk (рис. 4.11).

Преодоление G1/S и продвижение в фазе S требует актива­ции иных киназ — Cdk2, Cdk4 и Cdk6, которые взаимодейст­вуют уже с Gl-фазными циклинами (в частности, с cyclin D). Комплекс Cdk2 с первым G1 -фазным циклином индуцирует транскрипцию гена следующего циклина и т.д., продвигая клетки все дальше по циклу. Cdk2-cyclin D в самом начале за­мещается на Cdc2-cyclin Е, а тот в свою очередь на Cdc2-cyclin А, активирующий аппарат синтеза ДНК (рис. 4.12). Когда клетка входит в S-фазу, Gl-циклины деградируют и появляют­ся вновь лишь в G1 следующего цикла.

Контрольно-пропускные пункты (checkpoints). Любое стрес-сорное воздействие (например, отсутствие питательных ве­ществ, гипоксия и в особенности повреждение ДНК) блокиру­ет движение по циклу в одном из двух упомянутых контроль­ных пунктов (checkpoints). Во время этих остановок активиру­ются механизмы надзора, способные: а) обнаружить повреж­

дение ДНК, б) передать сигнал неблагополучия, блокирую­щий синтез ДНК или митоз, и в) активировать механизмы ре­парации ДНК. Благодаря этому обеспечивается стабильность генома. Как упоминалось выше, механизм контроля G1/S бло­кирует репликацию ДНК и активирует процессы репарации (или индуцирует апоптоз), тогда как механизм контроля G2/M запрещает митоз до завершения репликации. Дефекты этих механизмов могут привести к появлению дочерних клеток с поврежденным геномом.

В механизме checkpoint участвуют комплексы Cdk-cyclin и ряд дополнительных белков — Rb, р53 и др. Их совокупность об­разует систему «тормозов», не позволяющих клетке делиться в отсутствие адекватных стимулов. Кодирующие эти белки гены получили название генов-супрессоров. Особое значение этой системы заключается в том, что раковая трансформация клетки возможна только после ее инактивации. Важно иметь в виду, что в соматической клетке существует по два аллеля каждого из генов, в том числе и генов-супрессоров, и, следовательно, для их инактивации необходимы два независимых события (например, делеция одного аллеля и мутация другого). Именно в этом кро­ется причина того, что «спорадические» опухоли возникают от­носительно редко (вероятность возникновения в одной клетке

нескольких независимых мутаций, причем поражающих один и тот же локус обеих хромосом, относительно невелика), а «семей­ные» чрезвычайно часты (в «раковых» семействах один из двух наследуемых аллелей того или иного гена-супрессора исходно дефектен). В последнем случае система «тормозов» у всех клеток данного организма держится лишь на одном нормальном алле-ле, что резко снижает ее надежность и повышает риск возникно­вения опухоли. Именно это и происходит при наследственной ретинобластоме (делеция одного аллеля Kb) и других наследст­венных синдромах (делеция или повреждение одного аллеля р53 или других генов-супрессоров).

В механизме Gl/S checkpoint участвуют, помимо комплек­са Cdk-cyclin, Cdk-ингибирующие белки (CKI, Cdk inhibitory proteins). Последние взаимодействуют с комплексом Cdk-cy­clin и ингибируют его (рис. 4.13).

В семейство CKI входит несколько членов (в частности, р27, р1б, р21), которые продуцируются клеткой в ответ на разные стимулы и блокируют клеточное деление. Так, антимитогенный фактор TGFp (transforming growth factor P) индуцирует обрати­мый блок клеток в поздней Gl-фазе посредством высвобожде­ния р27 из комплекса с неким ингибитором, после чего р27 свя­зывается с Cdk2-cyclin Е и подавляет его активность. Напротив, митоген интерлейкин-2 (IL-2) инактивирует р27 и способствует тем самым продвижению клеток по циклу. Этот же представи­тель семейства CKI участвует, по-видимому, в феномене кон­тактного ингибирования (блоке деления клеток при соприкос­новении их поверхностей) — характерном свойстве нормальных клеток, отсутствующем у клеток опухолевых.

Сходную роль выполняет CKI р1б, который кодируется геном-супрессором MTS1 и взаимодействует с Cdk-cyclin D. CKI pi6 инактивирован во многих линиях опухолевых клеток и в клетках «семейной» меланомы. Строго упорядоченное во времени появление CKI обеспечивает их взаимодействие толь­ко с определенными комплексами Cdk-cyclin.

Особо важную роль в формировании блока G1/S играет CKI р21 — белок, известный также как WAF1 и CIP1 (рис. 4.14).

Синтез р21 индуцируется главным клеточным «хранителем ге­нома» белком-супрессором р53 (последний в свою очередь акти­вируется при возникновении различных повреждений ДНК и, в частности, при у-облучении клеток). WAF1/CIP1 связывается с комплексом Cdk2-cyclin. Ингибирование последнего предотвра­щает фосфорилирование супрессора Rb; в дефосфорилирован-ном состоянии Kb связывается с фактором транскрипции E2F1, который «запускает» «гены пролиферации», и ингибирует его.

В клетках с интактной ДНК содержание р53 исчезающе мало и соответственно отсутствует WAF1/CIP1; ничто не пре­пятствует протеинкиназной активности Cdk2-cyclin и фосфо-рилированию Rb. Комплекс Rb-E2F1 распадается, и высво­божденный из-под ингибирующего влияния транскрипцион­ный фактор E2F1 активирует группу генов, необходимых для вступления клетки в фазу синтеза ДНК.

У клеток с дефектным или отсутствующим р53 контроль­ный пункт G1/S неполноценен. Это проявляется в том, что повреждения ДНК, индуцированные ионизирующей радиа­цией или каким-либо другим способом, не приводят ни к за­держке клеток на границе фаз G1/S, ни к апоптозу. В резуль­тате в популяции накапливаются клетки со множественными нарушениями структуры ДНК; появляется и со временем на­растает нестабильность генома, которая ведет к появлению все новых клеточных клонов. Их естественный отбор лежит в ос­нове опухолевой прогрессии — постоянного «дрейфа» опухоли ко все большей автономности и злокачественности. Именно свойство нестабильности генома наделяет клетки опухоли, с одной стороны, замечательной приспособляемостью к услови­ям окружающей среды и «увертливостью» по отношению к ле­чебным воздействиям, а с другой — все новыми качествами, в частности способностью метастазирования.

«Выше» р53 в регуляторной цепи расположен белок, коди­руемый геном ATM (ataxia-telangiectasia mutated). Его функция состоит в активации р53 в ответ на повреждение ДНК ионизи­рующей радиацией. В свою очередь р53 активирует группу генов GADD (Growth Arrest and DNA Damage-inducible), про­дукты которых, по-видимому, «запускают» механизм репара­ции (см. рис. 4.14).