3.1.1. Номенклатура аллергенов

Номенклатура аллергенов была унифицирована в 1994 г. Номенклатурным субкомитетом по аллергенам (при ВОЗ). Эта номенклатура основана на таксономическом названии рода и вида источника аллергена. Сокращенное название аллергена приводится следующим образом. Первые три буквы латинско­го названия рода; отступ; первая буква вида; отступ; арабская цифра, например Der f 1 — Dermatophagoides farinae. Одна и та же цифра означает гомологичные аллергены разных видов: на­пример, антиген 5 из Dactylis glomerulata и Phleum pratense — Phi p 5 и Dac g 5. Дополнительные буквы в сокращенном обо­значении рода или вида используют для того, чтобы избежать путаницы: например, Ves v 5 — Vespula vulgaris, но Ves vi 5 — Vespula vidua. Изоформы аллергенов и их варианты обознача­ют дополнительными четырьмя цифрами. Первые две из них характеризуют изоаллерген, а следующие две — вариант. На­пример, четыре изоаллергена Amb а 1 (Ambrosia artemisiifolia) обозначают как Amb а 1.01; Amb а 1.02 и т.д., а варианты — как Amb а 1.0101; Amb а 1.0102 и т.д.

3.1.2. Идентификация и очистка аллергенов

Лечебные и диагностические аллергены, наиболее часто используемые в клинической практике, представляют собой водно-солевые экстракты исходного аллергенного сырья. Та­ковы водно-солевые экстракты пыльцы растений, домашней пыли, шерсти животных, экстракты насекомых и пр. Такие экстракты содержат не один, а несколько аллергенов, т.е. тех действующих начал, которые способны вызвать сенсибилиза­цию, переключение синтеза иммуноглобулинов на синтез IgE и взаимодействовать с аллергенспецифическим IgE, вызывая аллергическую реакцию. Между разными аллергенами может существовать структурная гомология в той или иной степени, что объясняет столь распространенные перекрестные аллер­генные свойства. Так, например, лица, имеющие повышенную чувствительность к аллергену березы, одновременно реагиру­

ют на пыльцу орешника, ольхи и на некоторые фрукты и овощи (в частности, на яблоки). Индивидуальные аллергены, содержащиеся в данном экстракте, классифицируют на глав­ные (основные), промежуточные и второстепенные. Такое подразделение основано на частоте реагирования на эти ком­поненты лиц с повышенной чувствительностью к цельному экстракту. За главные компоненты принимают те, на которые реагируют не менее 50 % лиц, имеющих повышенную чувстви­тельность к цельному экстракту. Для идентификации аллерге­нов и определения их состава используют методы химическо­го, иммунохимического и биохимического анализа. Среди них наиболее часто применяют методы иммуноэлектрофореза, электрофореза в додецилсульфате натрия — полиакриламид-ном геле (sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electropho­resis — SDS-PAGE) и изоэлектрофокусирования в комплексе с иммуноблоттингом. Поскольку каждый из этих методов имеет серьезные ограничения, окончательное заключение можно сделать только на основании сопоставления результатов, по­лученных разными способами оценки.

SDS-PAGE позволяет разделять белки по размеру их моле­кулы. Додецил натрия представляет собой сильный анионный детергент, который связывается с белками и маскирует собст­венный заряд белковых молекул. В таких условиях полиакрил-амидный гель выполняет роль простого молекулярного сита. Параллельное использование одновременно с образцами ал­лергена белковых маркеров с известной величиной молекуляр­ной массы (мол. массы) позволяет достаточно точно опреде­лить величину молекулярной массы компонентов, входящих в состав аллергена. Следует иметь в виду, что на результаты раз­деления может оказывать влияние гликозилирование белков, приводящее к значительному увеличению молекулярной массы белковых молекул. Использование восстанавливающих агентов (меркаптоэтанола или динитрофенола), разрушающих дисульфидные связи, позволяет достичь диссоциации димер-ных и полимерных белков и повысить их растворимость. Затем разделенные белки наносят на нитроцеллюлозные или фторполивиниловые мембраны. Нанесенные на мембраны белковые пятна («блоты») инкубируют в присутствии сыворо­ток крови больных, имеющих повышенную чувствительность к данному аллергену и соответственно содержащих IgE-анти-тела. Связывание IgE-антител с аллергенными белками иден­тифицируют при помощи использования анти-IgE-антител, меченных либо ^|251, либо ферментом соответственно аутора-диографически или по образованию хемилюминесцентного продукта. Результаты метода (Western blot technique) зависят от полноты ренатурации аллергенов в ходе процесса «блоттинга».

Изоэлектрофокусирование позволяет разделять белки в со­ответствии с их изоэлектрической точкой в градиенте рН, со­

здаваемом смесью соответствующих амфотерных молекул. Иммунохимическую идентификацию аллергенов проводят тем же приемом, что и при выполнении SDS-PAGE. Толкование результатов нередко затрудняется тем, что изоформы аллерге­нов обладают гетерогенностью заряда, разной степенью гли-козилирования и другими вариабельными характеристиками.

Перекрестный иммуноэлектрофорез представляет собой комбинацию первичного электрофоретического разделения в геле агарозы и последующего электрофореза под прямым углом в геле агарозы, содержащем специфическую антисыво­ротку. В зоне эквивалентных соотношений концентраций антигена и антител возникают преципитаты в виде «ракетных» следов. Выявление в них аллергенов достигается при помощи использования сыворотки крови больных, чувствительных к данному аллергену, с последующим добавлением анти-IgE-антител, меченных ¹²⁵1 (метод ауторадиографии). Понятно, что в этом случае результаты будут зависеть от качества антисыво­ротки, которая должна «распознавать» все антигенные компо­ненты аллергена, а также от достижения оптимальной кон­центрации антител для возникновения иммунопреципитации.

Данные, характеризующие молекулярный размер и точку изоэлектрофокусирования, являются обоснованием выбора методов очистки конкретного аллергена. Многие аллергены (ингаляционные и пищевые) представляют собой гликопро-теины с мол. массой от 5 до 70 кДа и имеют точку изоэлектро­фокусирования при рН от 4,0 до 7,0. Однако встречаются и белки со свойствами основания (катионные белки). У разных изоформ аллергенов могут быть разные величины молекуляр­ной массы и суммарного заряда, что зависит от соответствую­щих аминокислотных замещений и различий углеводных ком­понентов.

Поскольку аллергены являются растворимыми белками и гликопротеинами, то для их очистки используют принципи­ально те же методы, что и для очистки белков. Первый этап очистки состоит в экстракции исходного сырья. При этом должны быть созданы условия максимального извлечения ал­лергенов при минимальной степени их разрушения и денату­рации. Это достигается прежде всего подбором величины рН, ионной силы раствора, буферного состава, продолжительнос­ти экстракции в зависимости от особенных свойств данного аллергена. Использование низкой температуры в период экстракции снижает степень разрушения экстрагируемых мо­лекул. В тех случаях, когда в экстрагируемом материале могут присутствовать протеолитические ферменты, необходимо ис­пользовать ингибиторы протеаз, как, например, при приготов­лении аллергенов грибов и постельного клеща. При довольно длительных процедурах выделения аллергенов необходимо применять бактериостатические агенты-консерванты (мертио-

лат). Однако использовать их допустимо в очень низкой кон­центрации (0,005 %).

Различные физико-химические методы очистки базируют­ся на электрофоретическом и хроматографическом разделении материала, различающегося величиной молекулярной массы, заряда и гидрофобными свойствами. Для хроматографическо-го разделения в настоящее время используют варианты высо­коразрешающей жидкостной хроматографии (HPLC), преиму­щества которой состоят в большой емкости колонок, высоко­разрешающих свойствах используемых смол, большой скорос­ти разделения и высокой степени воспроизводимости.

Высокая степень очистки достигается с помощью методов аффинной хроматографии. При этом в качестве аффинного материала применяют либо соответствующие моноклональные антитела, либо лектины. Последние, разумеется, могут быть использованы в том случае, если аллергены являются глико-протеинами. Лектин-аффинная хроматография имеет преиму­щества при выделении гликопротеинов из большого объема и как этап последующего выделения из материала, полученного ионообменной хроматографией, так как связывание с лекти-ном не зависит от высокой концентрации солей. Избиратель­ность выделения аллергенов лектиновой хроматографией оп­ределяется характером углеводных компонентов гликопротеи­нов. Конканаваллин А распознает структуры, содержащие связанную с альфа-группами маннозу, а агглютинин пророст­ков пшеницы — олигосахара, связанные с аспарагином через сиаловую кислоту, N-ацетилглюкозу и остатки N-ацетилга-лактозамина. Роль охарактеризованных углеводных остатков в связывании с IgE может быть установлена сравнительной оценкой этого свойства гликозилированных и дегликозилиро-ванных аллергенных белков.

Чрезвычайно важной теоретической и практической про­блемой является вопрос о перекрестных свойствах разных ал­лергенов. Работы, посвященные изучению этих свойств, очень многочисленны и разнообразны. В одной из них в последнее время получены результаты, позволяющие удачно объяснить перекрестные свойства аллергенов пыльцы разных видов рас­тений. Показано, что такие перекрестные свойства могут быть связаны с растительными профилинами, содержащимися в пыльце растений. Эти профилины распознаются актином, входящим в состав оболочки растительной клетки. Выделение профилинов осуществимо хроматографией на колонках, со­держащих полипролин. Таким образом может быть получен продукт, ответственный за общие аллергенные свойства цело­го ряда аллергенов пыльцы растений.

Ферменты, входящие в состав аллергенов и ответственные за их аллергенную активность, могут быть выделены аффин­ной хроматографией с использованием соответствующих суб-

9—1385

129

стратов или ингибиторов этих ферментов. Так, один из инди­видуальных аллергенов, входящих в состав D. pteronissinus, имеет высокую гомологию с глутатион-Б-трансферазой и может быть выделен на колонке, содержащей глутатион. Груп­па аллергенов D. pteronissinus и D. farinae представляет собой трипсиноподобные серинэстеразы. Соответственно они могут быть выделены на аффинных колонках, содержащих ингиби­торы трипсина.

Наконец, молекулярное клонирование аллергенов делает принципиально возможным синтез неограниченного количе­ства клонально чистого белка или модифицированных аллер­генов и пептидов для последующего изучения их функции.