- •5.2.3. Виды патологических состояний у человека, связанные
- •1.1. Проявления, механизмы развития и регуляция апоптоза на уровне клетки
- •1.1.2. Многообразие пусковых механизмов апоптоза
- •1.1.3. Пути передачи внутриклеточных сигналов к развитию апоптоза (частные события)
- •1.1.4. Общий путь индукции апоптоза
- •1.1.5. Эндогенные регуляторы апоптоза
- •1.2. Роль апоптоза в многоклеточном организме
- •1.2.1. Апоптоз, процессы формообразования и клеточного гомеостаза на уровне организма
- •1.2.2. Роль апоптоза в иммунных процессах
- •1.3. Место апоптоза в патологии
- •Участие апоптоза а формировании типовых патологических процессов Изменение выраженности апоптоза
- •Повышение вероятности развития злокачественных опухолей
- •1.3.2. Патологические процессы, обусловленные ослаблением апоптоза
- •1.3.3. Патологические процессы,
- •2.1. Словарь сокращений и терминов
- •2.1.3. Цитокины
- •2.1.4. Конкретные иммунологические эффекторные реакции
- •2.2. Определение понятия «иммунитет»
- •2.3. Главные функции иммунной системы
- •2.4.1. Органы лимфопоэза
- •2.4.2. Характеристика лимфоцитов
- •2.5. Гуморальные факторы иммунитета
- •2.6. Стадии развития иммунного ответа
- •2.7. Иммунная подсистема кожи
- •2.8. Иммунная система слизистых оболочек
- •2.9. Патологические процессы с участием иммунной системы
- •2.9.1. Полноценная иммунная система
- •2.9.2. Генетические дефекты в иммунной системе
- •Дефект гуморального звена иммунитета (антитела, комплемент)
- •2.9.2.2. Патологические процессы с участием иммунной системы при общем тяжелом патологическом процессе в организме
- •2.9.3. Иммуностимулирующая терапия, неспецифичная по антигену
- •3.1. Аллергены и аллергенность
- •3.1.1. Номенклатура аллергенов
- •3.1.2. Идентификация и очистка аллергенов
- •3.1.3. Нашивные аллергены как гетерогенная и изменчивая популяция
- •3.2. Иммуноглобулин е:
- •3.2.1. Модель запуска синтеза IgE
- •Связывание аллергена поверхностным иммуноглобулином на в-клетке
- •Процессинг аллергена
- •Активация транскрипции на Запуск.Переключающий специфическом регионе Ig рекомбинации на синтез локуса IgE
- •3.2.2. Сигнал индукции синтеза IgE,
- •3.2.5. Независимая от взаимодействия cd40 с cd154 индукция синтеза IgE
- •3.2.6. Вспомогательные молекулы, усиливающие и сдерживающие влияния
- •Cd28 (т-клетка)
- •Усиление
- •Усиление экспрессии с080 (в-клетка)
- •3.2.7. Избирательность включения тъ2-клеток в IgE-omeem
- •3.2.8. Возможные способы оценки опосредуемого Тп2-клетками аллергического ответа в клинических условиях
- •3.3. Некоторые замечания
- •4.1.1. Классификация
- •4.1.2. Краткие эпидемиологические данные
- •4.1.3. Этиологические факторы канцерогенеза
- •4.1.4. Характерные свойства опухолей
- •4.1.5. Взаимоотношения опухоли и организма
- •4.1.6. Стадии развития
- •4.2.1. Изменения кариотипа
- •4.2.2. Признаки клеточной трансформации в культуре
- •4.2.3. Иммортализация опухолевых клеток
- •4.2.4. Межклеточная кооперация
- •4.3. Молекулярные механизмы опухолевого роста
- •4.3.1. Эндокринная, паракринная и аутокринная регуляция
- •4.3.2. Митогенная «рефлекторная дуга»
- •4.3.3. Клеточный цикл
- •4.3.4. Перенос митогенного сигнала
- •Неактивный Ras
- •I I ядро
- •Мекк мек »► erk
- •4.3.5. Реализация митогенного сигнала
- •4.3.6. Апоптоз
- •4.3.7. Механизмы опухолевой трансформации
- •I Мутантные по р53 клетки I доминируют в опухоли
- •Нормальный эпителий
- •5.1. Феномен стресса
- •5.1.1. Стресс-реакция
- •Стрессор
- •Побочные эффекты стресс-реакции адаптация (восстановление гомеостаза)
- •5.1.2. Стресс-система
- •Периферические и черепные нервы, кровь
- •Стресс-реакция
- •5.1.3. Стресс-лимитирующие системы
- •Стрессор
- •Ограничание высвобождения а и на в цнс и органах
- •I Ограничение cmpecc-реекции и ее повреждающих эффектов I
- •5.1.4. Роль соотношения активностей
- •5.1.5. Адаптивные и повреждающие эффекты стресс-реакции
- •5.2. Эмоциональный стресс и связанные с ним патологические состояния
- •5.2.1. Особенности эмоциональных стрессоров и эмоциональной стресс-реакции
- •5.2.2. Стрессорные патологические состояния и их возможные механизмы
- •5.2.2.1. Роль стресс-системы в формировании эмоционального стресса и патогенезе стрессорных повреждений
- •Субъективная оценка фактора
- •Слабая стресс-реакция или отсутствие стресс-реакции
- •5.2.3. Виды патологических состояний у человека, связанные с эмоциональным стрессом, и их механизмы
- •2 Х е м а 5.7. Патогенез первичного стрессорного повреждения сердца [Meerson f., 1991]
- •Стрессор
- •I | Активация стресс-системы. Стресс-реакция | Действие на сердце избытка катехоламинов и других гормонов. Активация аденилат-циклазы, фосфолипазы с
- •Нарушение функционирования Na -, к*- и Са2*- насосов сарколеммы, Са2* насоса спр
- •5.2.3.1.1. Ишемическая болезнь сердца и инфаркт миокарда
- •Уменьшение периферического сопротивления сосудов
- •5.2.3.1.2. Внезапная сердечная смерть
- •Отличительные признаки
- •Стрессорная аритмическая болезнь сердца
- •5.2.3.1.3. Гипертоническая болезнь
- •IЯзвенное поражение желудка
- •5.2.3.3. Система крови и иммунная система при эмоциональном стрессе
- •Уменьшение синтеза антител
- •5.2.3.4. Психический статус при эмоциональном стрессе и посттравматическое стрессовое расстройство
- •5.2.3.4.1. Нарушения психического статуса
- •5.2.3.4.2. Посттравматическое стрессовое расстройство2
- •5.2.4. Основы предрасположенности и устойчивости к стрессорным повреждениям
- •5.3. Принципы профилактики и коррекции стрессорной патологии
- •5.3.1. Профилактика и коррекция с помощью защитных эффектов адаптации к факторам среды
- •5.3.2. Коррекция с помощью
- •5.3.3. Использование приемов психотерапии при стрессорных психосоматических расстройствах
- •6.1. Характеристика боли
- •6.2. Физиология боли
- •6.2.1. Анатомо-функциональная организация ноцицептивной системы
- •6.2.1.2. Периферические алгогены
- •6.2.1.3. Первое переключение ноцицептивной информации (первичное ноцицептивное реле)
- •6.2.1.6. Обработка ноцицептивной информации в коре больших полушарий
- •6.2.2. Антиноцицептивная система мозга
- •6.3. Патофизиология боли
- •6.3.1. Соматогенные болевые синдромы
- •6.3.1.2. Механизмы развития вторичной гипералгезии
- •6.3.2. Патофизиология нейрогенных болевых синдромов
- •6.3.2.3. Периферические механизмы нейрогенной боли
- •7.1. Современные представления о свертывании крови
- •7.1.1. Механизмы свертывания крови
- •I Сосудистая стенка .
- •|Г* Фосфолипаза Аг
- •3 (Простат
- •I римооксан а2 pgi2
- •7.1.2. Механизмы ингибирования свертывания крови. Фибринолиз
- •7.2. Современные представления о природе тромбозов
- •7.2.1. Основные причины развития тромбозов
- •7.2.2. Лабораторная диагностика вероятности развития тромбозов
- •7.3. Геморрагии
- •7.3.1. Виды и основные причины развития геморрагии
- •7.3.2. Лабораторная диагностика геморрагических состояний
- •7.5. Лекарственная коррекция патологии гемостаза
1.1. Проявления, механизмы развития и регуляция апоптоза на уровне клетки
/././. Феноменология и методы выявления апоптоза
Наиболее характерные проявления апоптоза определяются тем, что первые события, связанные с его осуществлением, начинаются в ядре. В ядре регистрируются первые морфологические признаки апоптоза — конденсация хроматина с формированием его осмиофильных скоплений, прилежащих к ядерной мембране. Позже появляются вдавления ядерной мембраны и происходит фрагментация ядра. Отшнуровавшие-ся фрагменты ядра, ограниченные мембраной, обнаруживаются вне клетки; их называют апоптотическими тельцами. В цитоплазме происходят расширение эндоплазматического рети-кулума, конденсация и сморщивание гранул. Важнейший признак апоптоза — снижение трансмембранного потенциала митохондрий. Клеточная мембрана утрачивает ворсинчатость и в то же время образует пузыревидные вздутия. Клетки округляются и отделяются от субстрата. Проницаемость мембраны
Рис. 1.1. Развитие некроза и апоптоза клеток. Характерные морфологические проявления.
Таблица 1.1. Сравнительная характеристика апоптоза и некроза клеток
Показатели |
Апоптоз |
Некроз |
Пусковой фактор |
Сигнал, воспринимаемый мембранными рецепторами, или отсутствие сигнала |
Токсические и мем-бранотропные агенты, неадекватные внешние условия |
повышается лишь в отношении небольших молекул, причем это происходит позже изменений в ядре: если конденсация хроматина проявляется в пределах 1 ч, то повышение проницаемости для пропидия йодида — только через 3—5 ч. Как уже упоминалось, одной из наиболее характерных особенностей апоптоза является уменьшение объема клетки в противоположность ее набуханию при некрозе. В схематической форме морфологические проявления апоптоза и некроза отражены на рис. 1.1. Следует обратить внимание на увеличение размеров клетки и ранние изменения мембраны, но не ядра при некрозе и уменьшение размеров клетки с ранними изменениями в ядре, но не в цитоплазме при апоптозе. Признаки апоптоза и некроза сопоставлены в табл. 1.1.
Продолжение табл. 1.1
Показатели
Апоптоз
Некроз
Скорость развития
Локализация пер винного поврежде ния
Причины гибели клетки
Изменения размера клетки
Изменения ядра
Изменения в цитоплазме
Изменения клеточной мембраны
Состояние ДНК
Энергозависимость
Зависимость от синтеза макромоле кул
Примеры проявле ния
Методы выявления: морфологические тинкториальные
цитофлуоримет-рические
электрофоретиче-ские 1-12 ч В ядре
Деградация ДНК, нарушение энергетики клетки
Уменьшение (сморщивание)
Конденсация хроматина, пикноз, фрагментация
Конденсация цитоплаз мы, уплотнение гранул
Потеря микроворсинок, образование вздутий
Разрывы с образованием сначала крупных, затем мелких фрагментов
Зависит
Метаморфоз, отрицательная селекция лимфоцитов, гормонозависимая атрофия, интерфазная радиационная гибель лимфоцитов
Сморщивание клетки
Ослабление окрашиваемое™ ДНК-тропными красителями
Гиподиплоидность, уменьшение размеров клетки, появление фос-фатидилсерина на мембране
Формирование дискретных фракций («лесенки») при электрофорезе ДНК
В пределах 1 ч В мембране
Нарушение целости мембраны
Увеличение (набухание)
Набухание
Лизис гранул
Нарушение целости
Неупорядоченная деградация
Не зависит
Гибель клеток вследствие гипоксии, действия токсинов, вирусного цитолиза, комплементзависи-мого цитолиза
Набухание клетки
Окрашиваемость
суправитальными
красителями
Окрашиваемость йодидом пропидия
Размазанное пятно при электрофорезе ДНК
2—1385
17
Указанные морфологические проявления апоптоза изучены в модельных опытах in vitro. Апоптотические клетки трудно выявить в тканях in situ в связи с тем, что они быстро фагоцитируются не только макрофагами и нейтрофилами, но и другими окружающими клетками, не являющимися «профессиональными» фагоцитами. Быстрота фагоцитирования связана с появлением на их поверхности (вследствие реорганизации мембраны) некоторых молекул, распознаваемых фагоцитами; такими молекулами являются фосфосерин, тромбоспон-дин, десиалированные мембранные гликоконъюгаты. В результате фагоцитоза, которому клетки подвергаются уже в процессе развития апоптоза, их содержимое не выделяется в межклеточное пространство, как это бывает при некрозе, когда вокруг гибнущих клеток скапливаются их активные внутриклеточные компоненты, включая энзимы, закисляется среда, что способствует гибели других клеток и развитию очага воспаления. Апоптоз поражает индивидуальные клетки и практически не отражается на их окружении.
Главное проявление апоптоза — деградация хроматина. Ее основой служит ферментативное расщепление ДНК, которое происходит в несколько этапов с формированием все более мелких фрагментов. Сначала образуются фрагменты, включающие 700; 200—250; 50—70 тыс. пар нуклеотидов (т.п.н.), затем — фрагменты, содержащие 30—50 т.п.н. [Zhivotovsky В. et al., 1994J. На этой стадии происходят конденсация хроматина и инвагинации ядерной мембраны. После реализации этого этапа процесс становится необратимым. Затем наступает очередной этап деградации, который изучен наиболее полно и служит широко принятым опознавательным признаком апоптоза, — межнуклео-сомная дезинтеграция ДНК, т.е. разрывы нитей ДНК, находящихся между нуклеосомами. При этом образуются фрагменты, кратные по величине 180—200 пар нуклеотидов, что соответствует протяженности нити ДНК в пределах одной нуклеосомы. ЕИ-от тип деградации обычно завершается в течение суток. При всей типичности для апоптоза этого типа расщепления ДНК известны примеры, когда процесс ограничивается образованием более крупных фрагментов.
Деградация хроматина при апоптозе является активным процессом, зависящим от температуры, источников энергии, синтеза РНК и белка de novo. Различные этапы деградации ДНК катализируются разными формами эндонуклеаз, отличающимися субстратной специфичностью и условиями проявления активности (см. далее).
Несмотря на безусловно ключевую роль деградации ДНК в осуществлении апоптоза, между этими процессами нельзя поставить знак равенства. Во-первых, морфологические и биохимические изменения в цитоплазме и мембранах, характерные для апоптоза (снижение трансмембранного потенциала
митохондрий, накопление реактивных форм кислорода и т.д.), могут быть индуцированы в энуклеированных (безъядерных) клетках, т.е. в ситуации, когда деградация хроматина невозможна в связи с его отсутствием. Во-вторых, непосредственной причиной смерти клетки при апоптозе являются не разрушение ДНК и прекращение работы генов, поскольку их последствия сказываются несколько позже того срока, когда наступает апоптотическая гибель клетки. Предполагают, что ее гибель обусловлена энергетическим голодом, вызванным расходованием АТФ на работу по репарации поврежденной ДНК.
Методы выявления апоптоза достаточно разнообразны. Ориентировочная идентификация апоптоза возможна на основании вышеназванных морфологических признаков. Более доказательные подходы к оценке апоптоза основаны на выявлении формирующихся разрывов ДНК, ее деградации и потери клеткой части генетического материала. Часто используют электрофоретическое разделение полидезоксирибонуклеотид-ных фрагментов, экстрагируемых из клеток; на электрофоре-грамме фрагменты образуют характерную «лесенку» (серию прерывистых полос), отражающую дискретный характер меж-нуклеосомных разрывов [Zhyvotovsky В. et al., 1995]. Другие методы основаны на синтезе олигонуклеотидов из меченых предшественников, катализируемом дезоксирибонуклеоти-дилтрансферазой (TdT), и их встраивании в ДНК через ее свободные концы, формирующиеся в участках разрывов. Встраивание меченых олигонуклеотидов затем выявляется с помощью цитофлуорометрических или морфологических методов. На этом, в частности, основан TUNEL (TdT-mediated dUTR-biotin nick end-labeling) — метод оценки апоптоза [Gavrieli Y. et al., 1992].
В настоящее время широко используется скрининговый цитофлуорометрический метод определения численности апо-птотических клеток, основанный на утрате ими части хроматина. При этом фиксированные клетки окрашивают йодидом пропидия, который, проникая в ядро, взаимодействует с ДНК, что позволяет выявить процент гиподиплоидных клеток с помощью проточной цитофлуорометрии [McCloskey T.W. et al., 1994]. На регистрации снижения трансмембранного потенциала митохондрий основан метод определения апоптоза по изменению окрашивания липофильными катионными флуо-рохромами, например йодидом дигексилоксикарбоцианина или родамином, тройными к внутренней поверхности мембраны митохондрий. Наконец, широкое распространение получил метод раннего цитофлуорометрического обнаружения апоптоза по связыванию меченого аннексина V с фосфатидил-серином, который, как уже отмечалось, появляется на поверхности клеток, подвергающихся апоптозу. Параллельно клетки (нефиксированные) окрашивают йодидом пропидия, который
способен проникать лишь в клетки, подвергающиеся некрозу. Окрашивание одним аннексином служит показателем раннего апоптоза, окрашивание йодидом пропидия — свидетельством некроза, окрашивание обоими красителями — показателем позднего апоптоза, к которому присоединился вторичный некроз [Van Engeland М. et al., 1998].