Определение протеина с

Для определения протеина С разработано несколько методов: иммунохимический метод, метод с хромогенным субстратом и коагуляцион-ный вариант. Для функциональных методов ис­пользуется специфический активатор протеина С из яда змеи щитомордника, обозначаемый как протак.

Определение протеина С с использованием хро-могенного субстрата

Рис. 113. Принцип определения протеина С с использо­ванием хромогенного субстрата, АПС - активированный протеин С

Определение основано на активации протеи­на С активатором протак с последующим опре­делением (кинетическим методом или методом конечной точки) изменения оптической плотнос­ти пробы из-за образования паранитроанилина (рис. 113). Этот метод прост, специфичен, легко автоматизируется. Так как протеин С - витамин-К-зависимый гликопротеин, то при лечении не­прямыми антикоагулянтами (антагонистами ви­тамина К) появляются PIVKA-формы протеина С, которые не обладают антикоагулянтной актив­ностью, но определяются методами с хромоген-ными субстратами. Поэтому у больных, прини­мающих непрямые антикоагулянты, могут быть завышенными результаты определения протеина С хромогенными методами.

разцах исследуемой плазмы активируется про-таком. Для контроля тест проводится с и без протака (рис. 114). Активированный протеин С вызывает протеолиз и соответственно инактива­цию факторов Va и VIIIa в плазме (рис. 115). Последнее сопровождается удлинением времени свертывания в тесте АЧТВ, по которому оцени­вается активность протеина С в плазме пациен­та. Если фактор Va нечувствителен к активному протеину С, то АЧТВ не удлиняется в присут­ствии активатора протеина С. Рассчитывают отношение АЧТВ с протаком/АЧТВ без прота­ка, величина которого определяется в конкрет­ной лаборатории, так как тест зависит от исполь­зованных приборов и реактивов. Тем не менее этот коэффициент близок к 1 практически у всех больных с фактором Лейден и с дефицитом про­теина С и существенно выше 1 в случаях без де­фицита активности протеина С и при дисфунк­ции протеина S. Метод легко автоматизируется.

Коагуляционный метод оценивает актив­ность протеина С, фиксирующегося карбоксили-рованной частью на фосфолипидах. PIVKA-фор­мы не функционируют в этой системе, и тест не дает ложных результатов у пациентов, принима­ющих непрямые антикоагулянты или имеющих дефицит витамина К.

Исказить результаты теста могут такие фак­торы, как наличие мутации ф.V Лейден, присут­ствие в плазме волчаночного антикоагулянта,

Определение протеина С коагуляционным ме­тодом

Пробы пациентов сопоставляются с дефи­цитной по протеину С плазмой, которую полу­чают методом иммуносорбции. Протеин С в об-

Рис. 114. Принцип скрининга на резистентность к акти­вированному протеину С (РАПС). Активатор протеина С из змеиного яда (протак), добавленный к пробе, в норме существенно удлиняет АЧТВ, Если же имеет место РАПС, то удлинения АЧТВ в присутствии протака не происходит

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Рис. 115.Принцип определения протеина С коагуляционным методом. АПС - активированный протеин С, ФЛ фосфолипиды

терапия гепарином. Для получения достоверных результатов очень важно качество используемой протеин-С-дефицитной плазмы.

У некоторых пациентов, принимающих не­прямые антикоагулянты, выявляются чрезвычай­но низкие цифры содержания протеина С. Эти результаты могут быть связаны не только с ис­тинным дефицитом протеина С, но и с развитием резистентности фактора Va к АПС.

Определение протеина С иммунохимическим методом

Иммунохимическое определение протеина С применяется реже, чем функциональные методы. Это объясняется тем, что данный способ выявля­ет только классическое снижение концентрации протеина С и не определяет его функциональную неполноценность. Методическим обеспечением этого определения чаще всего служат автомати­зированный турбидиметрический метод или ELISA-тест.

Оценка результатов

В норме активность протеина С у взрослых составляет 70-140%.

Небольшое повышение протеина С отмеча­ется во время беременности, а уменьшение - в пос­леродовом и послеоперационном периодах.

Снижение содержания (активности) протеи­на С наблюдается при:

• врожденном (наследственном) дефиците или аномалиях протеина С;

• геморрагической болезни новорожденных;

• заболеваниях печени с нарушением функции;

• синдроме острой дыхательной недостаточно­ сти;

• менингококковом сепсисе;

• ДВС-синдроме;

• гемодиализе;

• лечении L-аспарагиназой;

• лечении пероральными (непрямыми) антико­ агулянтами (дефицит витамина К). Отдельные результаты могут колебаться в

зависимости от используемых методов и тест-на­боров, тем более что многие из них разработаны до того, как стала известна мутация гена факто­ра V Лейден. В общем случае разведение пробы может минимизировать влияние фактора V Лей­ден в коагуляционных тестах.

В некоторых случаях при лечении больных с дефицитом протеина С непрямыми антикоагулян­тами у них могут возникнуть некрозы кожи в ре­зультате рикошетных тромбозов. Если антикоагу­лянты назначаются в высокой дозе без поддержки гепарином, то возникает состояние, при котором протеин С очень быстро снижается (время его по­лужизни в системе циркуляции 4-6 ч). В то же вре­мя витамин-К-зависимые факторы свертывания, в том числе протромбин, остаются еще в пределах нормы (у них период полужизни 16-20 ч) (рис. 116).

Рис. 116. Быстрое снижение протеина С, превышающее уменьшение витамин-К-зависимых факторов свертывания, может быть причиной возникновения тромботического со­стояния (рикошетные тромбозы) при начале лечения высо­кими дозами непрямых антикоагулянтов

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Эта ситуация может усугубляться тем, что непря­мые антикоагулянты начинают назначать в слу­чае развития тромбозов или угрожающей ситуа­ции по тромбообразованию (при воспалении, ин­фекциях, лихорадке), когда система прокоагулян-тов активирована. Быстрое снижение протеина С провоцирует в этом случае массивное тромбооб-разование, проявляющееся вплоть до некрозов кожи. Непосредственно в период лечения непря­мыми антикоагулянтами (кумаринами) определе­ние протеина С затруднено. Определять его сле­дует до начала лечения кумаринами.