Определение фактора XIII

Исследование фактора XIII следует проводить в тех случаях, когда у больного имеются проявле­ния кровоточивости, но при этом ПВ, АЧТВ и тес­ты на первичный гемостаз нормальные. Среди ори­ентировочных и скрининговых тестов на недоста­точность ф.ХIII может указать только тромбоэлас-тограмма, на другие тесты дефицит ф.ХIII практи­чески не влияет. В то же время дефицит ф.ХIII име­ет выраженные клинические проявления и может быть причиной кровотечений неясной этиологии у человека на фоне полного здоровья, геморрагичес­кого синдрома при ДВС, гиперфибринолизе, после

удаления миндалин, при патологии печени и кост-но-мозгового кроветворения. Дефицит ф.ХIII мо­жет быть врожденным и приобретенным, в том чис­ле в результате появления аутоантител. Определе­ние дефицита ф.ХIII и его причины необходимо для назначения адекватного лечения, в частности ис­пользования концентратов фактора XIII. Для оп­ределения врожденного дефицита ф.ХIII использу­ются иммунохимические методы, в том числе ELISA, применяется ПЦР-диагностика для геноти-пирования врожденных мутаций. Однако ф.ХIII -это высокополиморфный белок, определение его

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

структурных компонентов часто бывает недоста­точным, поэтому требуются функциональные тес­ты с определением активности ф.ХIII.

Фотометрический метод

Фактор XIII - фермент трансглютаминаза, которая образует поперечные сшивки между пеп­тидами. При этом изопептидные связи образуют­ся между остатками глютамина и лизина, в реак­ции освобождается аммиак. Последний опреде­ляется в ферментной реакции с глютаматдегид-рогеназой (ГлДГ) и α-кетоглютаратом, кофакто­ром реакции является НАДН, окисляющийся до НАД (рис. 108). Измерение проводится фотомет­рически при длине 340 нм, метод может выпол­няться на биохимических анализаторах.

Инкорпорирующий метод

Разработан новый метод определения фак­тора XIII, основанный на введении субстрата в

иммобилизированный белок, которое обеспечи­вается фактором ХIIIа. Раньше иммобилизо­вался казеин. В новом методе используется физиологический субстрат-фибрин. Фактор ХIIIа инкорпорирует субстрат 5-(биотинамидо)-пен-тиламин (БАПА) в фибрин, который определя­ется количественно с конъюгатом стрептави-дин-щелочная фосфатаза (рис. 109). Инкорпо­рирующий метод позволяет оценивать физиоло­гическую роль мутации Val34Leu фактора XIII, которая сочетается с риском внутричерепных кровоизлияний и кровотечений из внутренних органов. В то же время больные с этой мутаци­ей фактора XIII практически не страдают ин­фарктом миокарда и венозными тромбозами. Мутацию Val34Leu фактора XIII не выявляет фотометрический метод. Инкорпорирующий метод может с успехом использоваться для мо-ниторирования больных с очень низким уров­нем ф.ХIII, что бывает при наследственных де­фицитах.

Рис. 108. Принцип определения фактора XIII фотометрическим методом

Р ис. 109. Принцип определения фактора XIII инкорпорирующим методом. БАПА - 5-(биотинамидо)-пентиламин, ЩФ-щелочная фосфатаза

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Тесты для определения гепарина

Антикоагулянты прямого действия широко используются для профилактики и лечения тром-боэмболической болезни. Традиционный тест АЧТВ полезен для контроля за лечением гепари­ном, когда гепарин применяется в относительно низких концентрациях (описан выше). При вы­соких дозах гепарина, например при операциях на открытом сердце или при диализе, АЧТВ не позволяет следить за эффектами гепарина. Анти-коагулянтное действие низкомолекулярного гепа­рина АЧТВ не улавливает.

Определение гепарина

с помощью хромогенных субстратов

Синтетические субстраты применяются для определения гепарина, особенно при использова­нии низкомолекулярного гепарина (НМГ). Гепа­рин определяется опосредованно: используется его способность усиливать комплексообразование ф.Ха или тромбина с антитромбином и тем самым подавлять активность этих протеаз, после чего оп­ределяется их остаточная активность (рис. 110). Тест с определением остаточной активности ф.Ха («анти-Ха-активность») применяется при контро­ле за лечением короткоцепочечным фракциони­рованным гепарином, который обладает большей тропностью к ф.Ха, чем к тромбину. Кроме того, ф.Ха - относительно стабильный фермент, поэто­му тест с использованием этого фактора техни­чески более надежный, чем тест с активным тром­бином.

Тест может выполняться в разных модифи­кациях: как кинетический метод, определение по начальной скорости или метод по конечной точке. В некоторых тестах используется насы­щающая концентрация AT, тогда тест обозна­чается как «общий гепарин», в других - исполь-

зуется эндогенный AT пробы, в этих случаях тест обозначается как набор для определения комплекса гепарин-АТ, или «активный гепа­рин». Определение гепарина с использованием хромогенных субстратов легко адаптируется для автоматических биохимических анализато­ров. На результаты теста с хромогенными суб­стратами не оказывают влияния продукты дег­радации фибрина (ПДФ) и повышенное содер­жание ф.VIII, которые меняют результаты при определении АЧТВ.

Для тестов на определение гепарина разра­ботаны и промышленно выпускаются калибра­торы - лиофильно высушенные препараты плаз­мы со стандартным содержанием гепарина. Ка­либраторы должны быть тестированы по стан­дарту ВОЗ, которому придано значение актив­ности 1,0 анти-Ха-Ед/мл. Терапевтический диа­пазон для лечения гепарином рекомендуется в пределах 0,3-0,7 анти-Ха-Ед/мл.

Определение гепарина

с помощью коагуляционных методов

Принцип определения гепарина с использо­ванием коагуляционных тестов подобен таково­му в тестах с хромогенными субстратами. Опре­деление основано на ингибировании свободного ф.Ха на первом этапе. После инкубационного периода выпадение сгустка вызывается добавле­нием реактивов, содержащих фосфолипиды с ад­сорбированными на них фактором V, протром­бином, фибриногеном из бычьей плазмы и СаС1₂ (рис. 111). Автоматизация этого метода затруд­нена, так как сигнал достаточно слабый для оп­тического метода. Тест может выполняться на цельной крови на коагулометрах с механической системой регистрации.

Рис. 110. Принцип определения содержания гепарина с использованием хромогенного субстрата, AT - антитромбин

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Рис. 111. Принцип определения содержания гепарина коагуляционным методом