Нефелометрические коагулометры

Нефелометрические коагулометры определя­ют момент образования сгустка по изменению рассеяния света. Новейшие разработки в этой области технологий нашли воплощение в коагу-лометрах фирмы «Sysmex» (Япония), в которых используется принцип определения сгустка по бо­ковому рассеиванию света (рис. 87). Метод рас­сеивания обеспечивает высокое качество анали­зов - высокую специфичность и чувствительность метода детекции сгустка даже для сложной липе-мичной или иктеричной плазмы.

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Рис. 86. Оптический двухканальный коагулометр KG-1 производства компании «Соrmау». Точность результатов повышается за счет синхронизации времени попадания ре­агента в измерительную кювету и запуска отсчета времени, а также исключения из применения магнитных мешалок в измерительных кюветах, Прибор эргономичен, термостат для проб и реагентов размещен в самом приборе, у кювет есть перемычки и держатели для удобства переноса из термо­стата в измерительные ячейки. Работа на приборе эконом­на, так как снижен расход реагентов за счет уменьшения объема кювет, использования многоразовых кювет

Рис. 87. Нефелометрический принцип измерения све­торассеяния, заложенный в основу определения момен­та выпадения сгустка на коагулометрах фирмы «Sysmex» (Япония). Метод позволяет повысить точность измерений и их воспроизводимость до 2-3%, а также снизить влияние на результат самого образца. Анализаторы работают на любых реагентах (в том числе на российских)

В табл. 15 указаны преимущества и недостат­ки автоматизированных коагулометров, исполь­зующих разные принципы регистрации выпада­ющего сгустка.

Современные коагулометры сочетают в од­ном приборе несколько методов измерения, по-

этому могут использоваться для комплексной оценки гемостаза. Так, фирма «Sysmex» предла­гает серию коагулометров с разными возможно­стями и производительностью для любой клини­ко-диагностической лаборатории любого уровня исследования гемостаза (рис. 88).

Таблица 15

Преимущества и недостатки различных методов обнаружения сгустка

Методы	Преимущества	Недостатки
Механический	Принципиальная возможность работы на цельной крови, высокая толерантность к типу используемых реагентов и пробирок, низкая стоимость анализаторов	Низкая чувствительность - нет детекции слабых сгустков, необходимо применять мешалки в пробах
Оптико-механический	Точность больше, чем в механическом мето­де, перемешивание пробы во время снятия показаний	Чувствительность ниже нефело-метрического метода, необходимо приме­нять мешалки в пробах
Турбидиметриче-ский	Чувствительность выше предыдущих мето­дов, низкая стоимость анализаторов	Чувствительность ниже нефело-метрического метода
Нефело­метрический	Высокая чувствительность, высокая точность измерения	Высокая стоимость прибора

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Рис. 88. Коагулометры фирмы «Sysmex»

Амидолитические методы с использованием хромогенных и флуорогенных субстратов

Применение синтетических хромогенных суб­стратов явилось прорывом при исследовании от­дельных ферментов или ингибиторов, которые не учитываются простыми коагуляционными теста­ми или очень трудны для стандартизации. Во мно­гих случаях хромогенные субстраты являются спе­цифичными и позволяют определить протеолити-ческую активность отдельных компонентов плаз­менного гемостаза и их ингибиторов. Эти тесты схожи с тестами клинической химии, поэтому лег­ко автоматизируются и могут выполняться на био­химических анализаторах как в клинико-диагнос­тических, так и в научных лабораториях.

Принцип тестов с хромогенными субстрата­ми представлен на рис. 89. Протеаза расщепляет короткоцепочечный пептид (из 3-10 аминокис­лот), к которому через эфирную связь пришит хромоген (в нашем случае паранитроанилин -pNA). Комплекс пептид-pNA имеет максимум поглощения в области короткого ультрафиоле­та, свободный pNA - при 380 нм. Итоговая кон­центрация pNA пропорциональна активности протеазы и определяется по увеличению погло­щения светового пучка с длиной волны 405 нм.

Рис. 89. Принцип определения активности протеолити-ческого фермента (протеазы) с использованием хро-могенного субстрата. Максимум поглощения паранитро-анилина, связанного с пептидом, находится в области ко­роткого ультрафиолета, а свободного паранитроанилина -380 нм, При длине волны 405 нм поглощает практически толь­ко свободная форма хромогена, на этой длине волны про­водится регистрация протеолитической реакции

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Для оценки активности факторов гемостаза стали использовать флуорогенные субстраты, в

частности 7-амино-4-метилкумарин (АМК), кото­рый имеет максимум эмиссии при 440 нм. Флуо­рогенные субстраты обладают большей аналити­ческой чувствительностью и позволяют измерить специфическую активность компонентов гемо­стаза в большем диапазоне, чем хромогенные суб­страты. Они могут использоваться для определе­ния компонентов гемостаза, присутствующих в плазме в следовых концентрациях или обладаю­щих относительно низкой активностью.

Преимущества использования хромогенных и флуорогенных субстратов:

• Высокая чувствительность метода. pNA или АМК обладают фотометрическими характе­ ристиками, позволяющими использовать ки­ нетические методы измерения.

• Высокая специфичность. Для каждой отдель­ ной сериновой протеазы системы гемостаза известна структура участка гидролиза. Моде­ лирование в короткоцепочечном пептиде спе­ цифической для конкретной протеазы после­ довательности из 3 аминокислот позволяет исключить влияние других протеаз на резуль­ таты исследования. При синтезе хромогенных субстратов для повышения специфичности используются L- или D-стереоизомеры амино­ кислот, а также различные блокирующие груп­ пировки, чтобы предупредить деградацию их

неспецифическими аминопептидазами. Кроме того, в тестах используется концентрация хро­могенных субстратов в несколько сотен мкмоль/л, что существенно выше, чем констан­та Михаэлиса (К_м) соответствующих фермен­тов, поэтому скорость реакции не зависит от концентрации субстратов. Факторы, которые необходимо учитывать при использовании хромогенных субстратов в практи­ческой клинико-диагностической лаборатории:

• Растворимость субстратов должна быть хо­ рошей.

• Реакция должна быстро достигать линей­ ность, чтобы использовать соответствующий набор на биохимических анализаторах, в ко­ торых часто бывает ограниченным время проведения измерения.

• В пробе не должно быть мутности, которую часто привносит фибрин или денатурирован­ ные белки.

Недостатки метода с использованием хромо­генных субстратов:

• Высокая стоимость реактивов.

• Возможное завышение результатов при иссле­ довании активности витамин-К-зависимых фак­ торов у лиц, получающих непрямые антикоа­ гулянты либо имеющих дефицит витамина К. Некоторые хромогенные субстраты, исполь­ зуемые для определения активности факторов свертывания, представлены в табл. 16.

Таблица 16

Типичные хромогенные и флуорогенные субстраты и ингибиторы, применяемые для выявления активности протеолитических ферментов системы гемостаза

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ