Подбор антикоагулянтов

Материалом для коагулологических исследо­ваний является плазма (рис. 69).

Для получения плазмы или крови для лабо­раторных исследований используют противосвер-тывающие вещества (табл. 11). Согласно стандар­ту для производителей DIN ISO Standard 6710 коммерческие пробирки с антикоагулянтом ме­тятся цветом крышки: пробирки с ЭДТА закры­ты крышкой светло-лилового (лаванды) цвета, пробирки с гепарином - зеленой, пробирки с цит­ратом - синей крышкой.

Трехзамещенный цитрат натрия обладает специфической способностью стабилизировать

Рис. 69. Получение фракций крови для проведения ко­агулологических исследований

лабильные факторы свертывания (V и VIII). Цит­ратная плазма, обогащенная тромбоцитами, ис­пользуется для изучения их агрегации. В связи с этим цитрат натрия является антикоагулянтом выбора для коагулологических исследований. В соответствии с рекомендацией ВОЗ концентра­ция цитрата должна быть 109 ммоль.

Кровь смешивают с 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 9:1. На этом этапе могут быть допущены три ошибки.

Первая ошибка - неточность приготовления раствора стабилизатора. Важно учесть, что трех­замещенный 5,5-водный цитрат натрия готовится в концентрации 3,8% (0,11 моль), а 2-водный - в кон­центрации 3,2%) (0,11 моль). Американский Коми­тет Стандартизации Клинических Лабораторий

Применение и механизм действия антикоагулянтов

Таблица 11

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

рекомендует для коагулологических исследовании буферный раствор 3,2% цитрата. Забуферивание ан­тикоагулянта способствует большей стабилизации лабильных факторов свертывания. Хранение ра­створа цитрата допускается в течение 1 недели при +2...+8 °С. Более длительное хранение приводит к бактериальному загрязнению и снижению концен­трации цитрата натрия.

Вторая ошибка связана с тем, что нарушает­ся принятое соотношение крови и раствора цит­рата (9:1), поскольку раствор цитрата остается в плазме и не проникает в клетки крови. Считает-

ся, что в пределах разведения крови цитратом 9:1 и 12:1 практически нет различий в результатах коагулологических тестов. Большее количество антикоагулянта по отношению к плазме может вызвать удлинение ПВ и АЧТВ (рис. 70).

Такая ситуация может возникнуть, когда в приготовленную заранее пробирку с цитратом набрано слишком мало крови (рис. 71).

Аналогичная ситуация возникает при раз­ном гематокрите (рис. 72): гематокрит в преде­лах между 0,25-0,55 (25-55%) несущественно вли­яет на результаты, при гематокрите свыше 60%

Рис. 70. Влияние разведе­ния крови антикоагулян­том на протромбиновый тест (ПТ) и активированное частичное тромбопластино-вое время (АЧТВ), Разведе­ние крови антикоагулянтом сопровождается удлинени­ем ПВ (снижение ПТ) и АЧТВ, при разведении меньшем, чем 8:1, это приводит к ре­гистрации ложноположи-тельного результата

Рис. 71. Взято недостаточное количество крови в ан­тикоагулянт - типичная преаналитическая ошибка. Боль­шее количество антикоагулянта по отношению к плазме может вызвать значительное изменение показателей ко-агулограммы

Рис. 72. Соотношение объема плазмы и раствора цитра­та при разном гематокрите. При высоком гематокрите со­здаются условия избыточного количества антикоагулянта и слишком сильного разведения плазмы с получением ре­зультатов, соответствующих состоянию гипокоагуляции. Наоборот, при низком гематокрите есть высокая вероят­ность регистрации «ложной» гиперкоагуляции

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

создается избыточная концентрация цитрата в плазме, приводящая к «ложной» гипокоагуля-ции. Напротив, при снижении гематокрита (ниже 25%) обнаруживается «ложная» гиперко­агуляция, кровь при смешивании с цитратом в отношении 9:1 может свернуться в пробирке еще до исследования. Высокий гематокрит - физио­логическая характеристика крови новорожден­ных, у взрослых высокий гематокрит возникает при полицитемиях (эритремиях), сердечной не­достаточности.

Перерасчет объема стабилизатора в соответ­ствии с гематокритным показателем позволяет избежать этой ошибки (табл. 12). Если же у боль­ного нет значительного сгущения крови или, на­оборот, анемизации, приемлемо стандартное со­отношение крови и цитрата (9:1).

Таблица 12

Соотношение объема антикоагулянта и венозной крови для постановки коагулограммы

Третья ошибка. Наиболее частой погрешно­стью при взятии крови является плохое или недо­статочное перемешивание ее со стабилизатором. Для предотвращения этого требуется немедлен­но после заполнения пробирки кровью до требу­емого объема закрыть ее крышкой (не резиновой) или чистой полиэтиленовой пленкой и 2-3 раза медленно перевернуть (не встряхивая).

Для рекальцификации к цитратной плазме добавляют определенное количество хлорида кальция. Причиной изменения времени сверты­вания может стать несоответствие добавляемо­го кальция содержанию цитрата: коагулологи-ческие исследования являются более чувстви­тельными к избытку кальция в плазме (высокий

гематокрит, слишком мало крови), чем к его не­достатку (низкий гематокрит, слишком много крови).

Для некоторых тестов рекомендуются специ­альные антикоагулянты. При исследовании фун­кции тромбоцитов практически любой антикоа­гулянт может быть источником ошибок. ЭДТА, флуорид и гепарин не используются при прове­дении традиционных тестов коагулограммы.

Сыворотка

Сыворотка, естественно, не может быть ис­пользована в тестах, основанных на определении выпадения фибрина. Кроме того, сыворотка практически не содержит факторов II, V, VIII и XIII, которые удаляются со сгустком, в сыворот­ке частично сохраняются ф.VII, -IX, -X и -XII. Сы­воротку можно использовать для исследования некоторых компонентов, на определение которых оказывают интерферирующий эффект компонен­ты плазмы, в частности, в сыворотке можно оп­ределять содержание продуктов деградации фиб­рина/фибриногена (ПДФ).

Хранение и центрифугирование

Кровь в пробирке необходимо тщательно перемешать, перевертывая пробирку, при этом не допускается образования пены. Нельзя трясти пробу, так как это может вызвать денатурацию белков и активацию тромбоцитов.

Сразу же после взятия крови происходит из­менение активности компонентов системы свер­тывания и фибринолиза. В пробе, не закрытой пробкой, возрастает рН из-за потери СО₂. След­ствием этого является увеличение времени свер­тывания. На стабильность рН пробы влияет бу­ферная система эритроцитов, а также использо­вание буферных растворов цитрата. В пробе кро­ви, хранящейся при комнатной температуре и зак­рытой пробкой, не происходит заметных измене­ний в результатах ПВ и АЧТВ. Эффект физиоло­гического забуферивания за счет эритроцитов исчезает в открытой пробирке при попадании в нее атмосферного воздуха.

Согласно международным рекомендациям срок доставки проб в лабораторию (ARUP Laboratories, 2002) для исследования показате-

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

лей гемостаза не должен превышать 45 минут

после взятия крови у пациента. Стабилизиро­ванную кровь до центрифугирования (в том числе и в процессе транспортировки) хранят при комнатной температуре (+18... +25 °С). Транспортировка крови на большие расстоя­ния и ее частое встряхивание искажают резуль­таты исследования. Кровь нельзя хранить во льду (что делается в некоторых клиниках), так как это может привести к холодовой актива­ции фактора XII (процесс запускается через контактную фазу и развивается достаточно ча­сто) и вызвать значительные изменения функ­ции тромбоцитов.

Центрифугирование для получения плазмы должно проводиться при ускорении 1500-2000 g в течение 10 минут, при этом получается плазма, «бедная» тромбоцитами. Если пробы необходи­мо заморозить перед проведением теста, то пос­ле размораживания рекомендуется повторно от-центрифугировать пробу и работать с суперна-тантом. Это делается для удаления остатков раз­рушенных тромбоцитов, фосфолипидов и белков их мембран, которые могут влиять на некоторые коагуляционные тесты.

Проверка исследуемых образцов перед выполнением тестов

Проверка образцов крови или плазмы перед проведением коагуляционных тестов позволяет избежать многих ошибок, связанных с преанали-тическими погрешностями.

Неправильное соотношение кровь/цитрат можно определить, если объем крови в пробирке меньше или больше, чем требуемый. При малом объеме крови будет зарегистрировано ложное удлинение коагуляционных тестов.

Пробы с видимыми сгустками фибрина. В за­висимости от степени свертывания коагуляцион­ные тесты могут быть укорочены, нормальны или удлинены.

Гемолиз может произойти при хранении не-отцентрифугированной крови или после центри­фугирования. В таких тестах результаты варьи­руют в зависимости от степени гемолиза. Если гемолиз присущ in vivo, что подтверждается взя­тием нового образца, то тесты могут выполнять­ся для оценки гемостатической ситуации. Если гемолиз произошел после взятия крови, то такие образцы следует отбросить, чтобы не получить ложных результатов.

Тесты для оценки сосудистого и тромбоцитарного компонентов гемостаза

Традиционные тесты на исследование сосу­дистого и тромбоцитарного компонентов гемо­стаза, в том числе пробы на резистентность (ломкость) капилляров, пробы на длительность и величину капиллярного кровотечения, под­счет тромбоцитов в камере, изучение размеров тромбоцитов в мазке, визуальные методы на

.

спонтанную и индуцированную агриегацю, хо­рошо известны и представлены во многих по­собиях. В настоящем изложении остановимся только на относительно новых методах, отра­ботанных на новой лабораторной технике, по­ступающей в клинико-диагностические лабора­тории.

Время кровотечения

Время кровотечения - это время от момента нанесения стандартной раны кожи до момента прекращения вытекания крови. Оно характери­зует функциональную активность тромбоцитов и взаимодействие тромбоцитов с сосудистой стен­кой. Время кровотечения не выявляет всех тром-боцитарных нарушений (такого метода вообще не существует), этот скрининговый тест позволя­ет заподозрить тромбоцитопатии различного ге-

неза, болезнь Виллебранда и нарушения проаг-регантных свойств сосудистой стенки. После вы­явления патологии нет необходимости повторять это исследование, нужно использовать более чув­ствительные и специфичные методы. У этого ме­тода есть серьезные недостатки: Метод плохо стандартизуется. Результаты

теста позволяют лишь предположить наличие

тех или иных нарушений.

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Низкая чувствительность. Отсутствие удли­нения времени кровотечения не всегда позво­ляет исключить нарушения тромбоцитарно-го или сосудистого звеньев гемостаза. Низкая специфичность не позволяет одно­значно интерпретировать результаты метода.

Однако это наиболее доступный метод для вы­явления нарушений взаимодействия тромбоцитов с сосудистой стенкой. Кроме того, это дешевый ме­тод, позволяющий заподозрить нарушения соответ­ствующего звена гемостаза и решить вопрос о необ­ходимости дальнейших углубленных исследований.