Основные понятия фотоколориметрии

Фотоколориметрия – один из самых распространенных методов исследования в биохимии и медицине. Основан на измерении поглощения света окрашенным веществом в видимой области спектра от 400 до 800 нм. Метод может быть использован для определения концентрации окрашенного вещества в растворе путем измерения поглощения света при одной или нескольких длинах волн, а также для определения активности ферментов, если субстраты или продукты ферментативной реакции могут быть окрашены с помощью реагентов и поглощать свет в видимой области спектра.

В основе количественных фотоколориметрических методов иссле-дования лежит закон светопоглощения Бугера-Ламберта-Бера: Интенсивность монохроматического светового потока, прошедшего через слой раствора поглощающего вещества, ослабляется по экспоненциальному закону

I=I₀10^{-k C l},

где I - интенсивность светового потока, прошедшего через слой окрашенного раствора,

I₀ - интенсивность падающего светового потока,

k- коэффициент светопоглощения,

С - концентрация вещества,

l- толщина слоя раствора.

Более удобна логарифмическая форма закона:

Оптическая плотность раст­вора прямо пропорциональна концентрации растворен­ного вещества и толщине слоя раствора

D=ξC l,

где D – оптическая плотность раствора, характеризует поглощение света веществом, D=lgI₀/I;

C – молярная концентрация раствора, моль/л;

l - толщина слоя раствора, численно равная рабочему расстоянию кюветы, см;

x - молярный коэффициент светопоглощения

вещества для определенной длины волны света, или молярная экстинкция. Она равна оптической плотности 1М раствора, помещенного в кювету с толщиной слоя 1 см ( при С = 1 моль/л и I = 1 см, D = x), является для данного вещества величиной постоянной. Может быть определена по справочнику или, чаще, определяется экспериментальным путем.

Кроме оптической плотности (D), на практике часто используется величина светопропускания (Т), характеризующая способность окрашенного раствора пропускать световой поток: Т =I/I₀, или T(%)=(I*100%)/I₀. Обозначения см. выше. Оптическая плотность и величина светопропускания связаны между собой логарифмической зависимостью: D=lg(1/T).

Отклонения от закона Бугера-Ламберта-Бера могут быть обусловлены присутствием посторонних примесей в растворе, процессами электролитической диссоциации, гидратации, гидролиза и другими причинами.

Устройство и принцип работы фотоэлектроколориметра

Микроколориметр медицинский фотоэлектрический МКМФ-1 пред­назначен для измерения коэффициентов пропускания или оптической плотности окрашенных растворов при биохимическом анализе с целью количественного определения различных компонентов биологических растворов.

Диапазон измерений коэффициента пропускания от 5 до 100 %, значений оптических плотностей от 0 до 1,3.

Рабочий спектральный диапазон 420-650 нм обеспечивается светофильтрами. Для выбора светофильтров используют 2 пробы исследуемого вещества различной концентрации и измеряют их оптические плотности с различными светофильтрами. Светофильтр, при котором разность оптических плотностей двух исследуемых проб максимальна, обеспечивает наибольшую чувствительность метода. Выбранный свето-фильтр пропускает лишь тот диапазон длин волн, который максимально поглощается исследуемым веществом.

Таблица для выбора светофильтров

Цвет раствора	Область максималь ного погло щения лучей раствором	Цвет светофильтра
Желто-зеленый	400-500	фиолетовый
желтый	450-480	синий
Оранже вый	480-490	зелено-синий
красный	480-500	сине-зеленый
Пурпур ный	500-560	зеленый
Фиолето вый	560-575	желто-зеле ный
синий	575-590	желтый
зелено-синий	590-625	оранжевый
сине-зеленый	625-700	красный

Микроколориметр работает от сети переменного тока с частотой 50 Гц и номинальным напряжением 220В. Время установления рабочего режима микроколориметра после включения не превышает 1ч.

Микроколориметр измеряет оптическую плотность (D) или коэффи-циент пропускания (T,%) исследуемого раствора относительно контрольного раст­вора. В качестве контрольного раствора используется кювета с дистилли-рованной водой или контрольным раствором, опти­ческая плотность которой принимается равной нулю (коэффициент про­пускания 100%).

На пути светового пучка поочередно устанавливают контрольный и исследуемый растворы.

Световой поток от лампы накаливания, проходя через оптичес­кую систему и исследуемый раствор в кювете, попадает на свето­чувствительный слой вакуумного фотоэлемента, который является элементом отсчетно-измерительной схемы. В зависимости от значе­ния коэффициента пропускания исследуемого раствора, изменяется световой поток, прошедший через раствор и падающий на фотоэлемент. При этом изменяется ток фотоэлемента, а следовательно и электри­ческий сигнал, подаваемый на микроамперметр.

Концентрация раствора определяется при помощи калибровочного графика зависимости оптической плотности раствора от его концент­рации (по таблице, составленной по данным такого графика) или путем сравнения с эталонным раствором с известной концентрацией вещества.

На лицевой панели прибора расположены следующие органы управ­ления и сигнализации:

- микроамперметр с двумя шкалами: шкалой коэффициентов про­пускания (Т,%) и шкалой оптических плотностей (D);

- диод светоизлучающий, сигнализирующий о наличии напряжения питания;

переключатель СЕТЬ для включения микроколориметра;

- ручка переменного резистора УСТАНОВКА НУЛЯ;

- ручка переменного резистора УСТАНОВКА 100% Т;

Непосредственно перед лицевой панелью, на горизонтальной плоскости съемной крышки находятся:

- гнездо для установки рабочих светофильтров;

- кюветное отделение и гнездо для установки контрольных светофильтров, закрывающихся светозащитной крышкой.

Под съемной крышкой укреплена в патроне лампа накаливания - источник света, эле­менты оптической схемы, а также преобразователь.

На задней панели прибора расположены вставки плавкие, шнур питания, оканчивающийся вилкой штепсельной двухполюсной с зазем­ляющим контактом, гнездо для подключения микропроцессора

ОПТИЧЕСКАЯ СХЕМА МИКРОКОЛОРИМЕТРА

Световой поток от источника I собирается линзовым конденсором 2, который дает изображение нити источника в центре кюветы. На пути луча устанавливается светофильтр 3. В кюветном отделении устанавливается сменная кювета 4. После кюветы свет падает на светочувствительный слой фотоэлемента 5. Перед фотоэлементом может быть установлена заглушка для перекрытия светового потока.

1 2 3 4 5

X ———--à А ————> В ———> С ————> Д

Источник Линзовый Свето- Сменная Вакуумный

света конден- фильтр кювета фотоэлемент

(лампа на- cатор

каливания)

ПОДГОТОВКА К РАБОТЕ

1. Присоедините микроколориметр к электросети при помощи сете­вого шнура с вилкой двухполюсной и заземляющим контактом.

2. Установите в гнездо для рабочих светофильтров фильтр, соответствующий методике измерения биологической пробы.

3. Осмотрите рабочую поверхность кюветы. На них не должно быть видимых глазом грязных пятен, ворсинок и пыли. Наполните кювету дистиллированной водой или контрольным раствором.

4.Установите кювету в кюветное отделение.

5.В гнездо для установки контрольных светофильтров поместите заглушку, предохраняющую фотоэлемент.

6. Закройте крышку кюветного отделения.