7. Этапы занятия и контроль их усвоения

N п\п	Этапы проведения занятия	Формы проведения	Время (мин.)
7.1	Постановка задачи.	Излагает преподаватель.	5
7.2	Контроль исходного уровня знаний.	Тестовый контроль	10
7.3	Разбор теоретического материала.	Опрос студентов. Строение белковой молекулы. Принципы фотометрии, строение и работа фотоэлектро- колориметра, построение калибровочного графика	90
7.4	Приобретение практических навыков	Выполнение лабораторной работы, оформление протоколов работы и проверка протоколов преподавателем.	70
7.5	Подведение итогов занятия. Задание на дом	Излагает преподаватель.	5

Количественные методы определения белков

1. Азотометрический метод Къельдаля – основан на определении содержащегося в белке азота. Белок минерализуют. Углерод при этом окисляется до СО₂, водород образует воду, а азот выделяется в виде NH₃. Аммиак связывается серной кислотой и превращается в сернокислый аммоний. В специальном приборе сернокислый аммоний разлагается концентрированной щелочью с образованием аммиака. Аммиак перегоняется и улавливается титрованным раствором серной кислоты. Избыток кислоты, не вступивший в реакцию с аммиаком, оттитровывают раствором щелочи. Для определения наличия аммиака в воздухе ставят контрольный пробу, в котором вместо анализируемой жидкости берут дистиллированную воду. Полученные данные вычитают из данных опыта. Результаты определения концентрации азота умножают на 6.25, т. к. концентрация азота в разных белках составляет примерно 16%.

2. Весовые (гравиметрические) методы – основаны на высушивании белковых растворов до постоянной массы и определении веса белков на аналитических весах.

3. Рефрактометрические методы – основаны на определении с помощью рефрактометра коэффициента преломления света (n_D²⁰) белкового раствора при 20⁰ С.

Степень рефракции раствора обусловлена количеством, размерами, физическим состоянием растворенных в нем частиц, а также температурой окружающей среды. В сыворотке крови величина рефракции зависит в первую очередь от количества и качества белков. Определив значение показателя преломления, по таблице находят величину концентрации белка.

4. Спектрофотометрические – на определении поглощения белковых растворов при 280 нм.

Из аминокислот, входящих в состав белков, лишь триптофан, тирозин

и в, меньшей степени, фенилаланин обладают заметным поглощением в ультрафиолетовой области спектра. Оптическая плотность растворов белков, содержащих эти аминокислоты, при 280 нм прямо пропорциональна концен-трации белка в растворе. Поскольку большинство белков содержат остатки тирозина, измерение поглощения при 280 нм с помощью спектрофотометра представляет собой быстрый и удобный способ определения содержания бел-ков в растворе. Этот метод дает хорошие результаты с гетерогенной смесью белков, а также с препаратами индиви-дуальных белков, молярный коэффи-циент экстинкции которых может быть измерен или вычислен, исходя из аминокислотного состава. Концентрацию белка рассчитывают, исходя из известного коэффициента экстинкции (D=xCl, C=D/xl) или определяют с по-мощью предварительно построенной калибровочной кривой. Если коэффи-циент неизвестен, можно воспользоваться номограммой Адамса. На номо-грамме на шкалах 2 и 3 отложены значения оптической плотности растворов белка соответственно при 280 и 260 нм, на шкале 1 - концентрация белка в мг/мл. Определяют оптическую плотность исследуемого раствора белка при 280 и 260 нм. Через соответствующие точки на шкалах 2 и 3 проводят вооб-ражаемую прямую, точка ее пересечения со шкалой 1 дает концентрацию белка в растворе. Использование номограммы Адамса удобно еще и потому, что при этом учитывается загрязнение раствора белка нуклеиновыми кис-лотами, которые имеют максимум поглощения при 260 нм.

5. Фотоколориметрические – на измерении поглощения окрашенных продуктов реакции в видимой области спектра.

В клинической и санитарно-гигиенической практике наиболее распростра-нены спектрофотометрические и фотоколориметрические методы коли-чественного определения белка.