Клиническое значение определения активности лактатдегидрогеназы.

В связи с тем что фермент ЛДГ содержится практически во всех тканях, констатация повышения общей активности лактатдегидрогеназы не имеет большого значения для дифференциальной диагностики заболеваний внутренних органов.

Активность ЛДГ в сыворотке крови возрастает у больных, страдающих анемией, обширным карциноматозом, опухолями, лейкозами, лимфомой, вирусным и невирусным гепатитом, обтурационной желтухой, циррозом печени, различными заболеваниями почек, опорно-двигательного аппарата, инфарктом миокарда и легкого, а также при любом другом повреждении клеток, приводящем к цитолизу и утрате цитоплазмы (этот фермент, широко представленный в тканях организма, легко переходит в плазму крови при некробиотических процессах в клетках).

Относительная активность изоферментов ЛДГ₄ и ЛДГ₅ повышена у всех больных инфекционным гепатитом в первые 10 суток. Характерно, что степень повышения не зависит от тяжести заболевания. После наступления клинического выздоровления у трети пациентов увеличение относительной активности ЛДГ₄ и ДДГ₅ является единственным показателем, свидетельствующим о незаконченном восстановительном процессе в печени.

У больных инфарктом миокарда активность фермента в сыворотке крови повышается через 8—10 ч после начала приступа, достигает максимума через 24-28 ч, остается увеличенной на протяжении первой недели заболевания, нормализуясь к 8-9-м суткам.. Ценность данного теста особенно велика в неясных случаях заболевания, при нетипичной клинической и электрокардиографической картине инфаркта миокарда

К увеличению обшей активности ЛДГ приводит прием алкоголя, кофеина, введение анаболических стероидов, тестостерона, обезболивающих препаратов, дикумарина, хинидина, сульфаниламидов, кодеина, клофибрата, мисклерона.

Существует две группы причин, обусловливающих снижение активности фермента в крови и тканях. Одна из них связана с наличием ингибитора в сыворотке (плазме) крови, вторая - с генетическими нарушениями.

Литература: В.С.Камышников Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике. Москва, «МЕДпресс-информ», 2004

Методы определения активности ферментов

По способу измерения скорости ферментативной реакции различают:

1 .Измерение по конечной точке. При этом определяют содержание продуктов реакции в инкубационной среде после фиксированного времени инкубации и остановки ферментативной реакции.

2. Кинетическое измерение с непрерывным (многоточечным) измерением

абсорбции в ходе ферментативной реакции.

3 .Двухточечное измерение - при этом способе выбирают линейный участок

кривой, определяют абсорбцию дважды - в начале измерения и в конце.

4. Измерение по начальной скорости, когда скорость реакции нелинейна и

снижается во времени, т.к. возможна инактивация фермента во времени или продукты реакции влияют на ее скорость.

По технике исполнения методы определения активности ферментов зависят от химической природы субстрата или продукта:

1. Спектрофотометрический метод.

Многие субстраты или продукты ферментативных реакций поглощают свет либо в видимой, либо в ультрафиолетовой области спектра. Принцип метода заключается в измерении концентрации субстрата или продукта по величине оптической плотности раствора.

В большом количестве аналитических наборов исполъзуется оптический тест Варбурга, который основан на том, что один из продуктов дегидрогеназной реакции НАД·Н или НАДФ·Н имеет максимум поглощения при длине волны 340 нм, а их окисленные формы при этой длине волны практически не поглощают. Активность фермента эквивалентна приросту

( или уменьшению) оптической плотности при этой длине волны.

2. Фотоколориметрический метод.

Позволяет измерить оптическую плотность окрашенного раствора, который поглощает свет в видимой области. Если субстрат или продукт ферментативной реакции сами не имеют окраски, то используется их химическая модификация с получением окрашенных производных.

3. Флуоресцентный метод.

Флавиновые соединения (а также НАД⁺) сильно флуоресцируют при воздействии на них светом определенной длины волны в окисленной форме и теряют эту способность при восстановлении. В методе часто используются специальные флуоресцентные метки и красители. Флуоресцентный метод позволяет существенно повысить чувствительность и расширить диапазон измерения по сравнению с оптическими методами измерения абсорбции.

4. Газометрический метод.

Используется для наблюдения за ходом реакций, в которых один из компонентов находится в газообразном состоянии. Наиболее современным является газометрический метод О.Варбурга, основанный на применении предложенного им аппарата с встроенным манометром для измерения давления газа. Метод используется для изучения оксидаз (поглощение О₂), декарбоксилаз (выделение СО₂) и др.

5. Титрометрический метод.

Титрометрический метод существует в алкалиметрическом или ацидометрическом варианте, т.е. определении титра кислоты или щелочи, образовавшейся в ходе реакции.

Например, один из методов определения активности ацетилхолинэстеразы основан на титровании количества уксусной кислоты, образовавшейся при ферментативном расщеплении ацетилхолина.

6. Поляриметрический метод.

Принцип метода основан на определении изменения удельного вращения раствора по мере протекания ферментативной реакции. Реакция проводится в трубке поляриметра

Тестовый контроль по теме «Активация и ингибирование ферментов».

Тест 1

Выберите правильный ответ:

Необратимое ингибирование фермента возникает, если:

а) фермент и ингибитор связаны ковалентно

б) фермент и ингибитор связаны ионными связями

в) фермент и ингибитор связаны водородными связями

г) между ферментом и ингибитором гидрофобное взаимодействие

Тест 2

Выберите правильный ответ

Активатором ацетилхолинэстеразы является:

а) тетраалкиламмоний хлористый

б) ацетон

в) хлористый кальций

г) хлористая ртуть

д)карбофос

Тест 3

Выберите все правильные ответы

Видами быстрой регуляции активности ферментов являются:

а) индукция синтеза фермента

б) ковалентная модификация фермента

в) репрессия синтеза фермента

г) аллостерическая регуляция

д)образование множественных форм

Тест 4

Выберите правильный ответ:

Предшественником кофермента сукцинатдегидрогеназы является:

а) Витамин РР

б) Витамин В₁

в) Витамин В₂

г) Витамин В₆

д)Витамин С

Тест 5

Выберите номер правильного ответа:

Предшественником кофермента аланинаминотрансферазы является:

а) Витамин РР в) Витамин В₂

б) Витамин В₁ г) Витамин В₆

д)Витамин С

Тест 6

Выберите все правильные ответы:

Обратимое ингибирование фермента возникает, если:

а) фермент и ингибитор связаны ковалентно

б) фермент и ингибитор связаны ионной связью

в) фермент и ингибитор связаны водородной связью

г) между ферментом и ингибитором гидрофобное взаимодействие

Тест 7

ВЫБЕРИТЕ ВСЕ ПРАВИЛЬНЫЕ ОТВЕТЫ:

Видами медленной регуляции активности ферментов являются:

а) индукция синтеза фермента

б) ковалентная модификация

в) репрессия синтеза фермента

г) аллостерическая регуляция

д)образование множественных форм

Тест 8

Выберите все правильные ответы:

Неконкурентное ингибирование происходит, если:

а)субстрат и ингибитор схожи по структуре

б)субстрат и ингибитор не схожи по структуре

в) ингибитор связывается в активном центре фермента

г) ингибитор связывается не в активном центре фермента

Тест 9

Выберите все правильные ответы:

Активность ферментов можно определить следующими методами:

а) спектрофотометрическими

б) полярографическими

в) титрометрическими

г) потенциометрическими

д)нефелометрическими

Тест 10

УСТАНОВИТЕ ПРАВИЛЬНУЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

Этапы быстрой регуляции ферментов:

а)присоединение эффектора в аллостерический центр фермента

б)изменение конформации активного центра

в)повышение активности фермента

г)образование молекулы эффектора

д)изменение конформации фермента

Тест 11

Установите соответствие

(для каждого вопроса-несколько правильных ответов, каждый ответ может быть использован один раз.)

Вид ингибирования Ингибитор сукцинатдегидрогеназы

1) обратимое а) хлористый кадмий

2) необратимое б) йодацетат

в) перекись водорода или другой окислитель

г) малонат

д) оксалоацетат