II.Диализ

Ход работы: в 2 пробирки наливают раствор яичного белка, содержащего примесь хлорида натрия; в одной делают биуретовую реакцию, в другой реакцию на ионы хлора с нитратом серебра в присутствии азотной кислоты – 5к. белка + 3 к. AgNO₃ . в двух других пробирках делают те же реакции с дистиллированной водой. Раствор яичного белка наливают в диализатор, который погружают в стакан с дистиллированной водой. Через 1 час вынимают диализатор из стакана и вновь, с небольшими порциями воды (диализата) и раствора яичного белка (диализируемой жидкости), проделывают биуретовую реакцию и реакцию на ионы хлора.

Название реакции	Диализируемая жидкость (солевой раствор белка – содержимое внутреннего такана)		Диализат (содержимое наружного стакана)
	до опыта	после опыта	до опыта	до опыта
1. биуретовая 2. на ионы хлора

Вывод

Методы разделения белков.

1) Высаливание нейтральными солями

2) Хроматография

3) Гель-фильтрация

4) Ультрацетрифугирование

5) Изоэлектрофокусирование

6) Температурная денатурация

7) Иммунологические методы

8) Электрофорез

III. Фракционное высаливание белков. Разделение альбуминов и глобулинов

Ход работы: к 1 мл раствора белка добавляют равный объем (1 мл) насыщенного (50%) раствора сульфата аммония, хорошо перемешивают и оставляют на 10 мин для более полного осаждения белка. Через 10 минут образовавшийся осадок отфильтровывают через складчатый фильтр. В фильтрат добавляют крупинки кристаллического сульфата аммония до появления осадка (образуется 100% р-р сульфата аммония).

Результаты

№ пробирки	Субстрат	Степень насыщения раствора сульфата аммония	Результат	Какой белок выпадает в осадок
1. 2.

Вывод:

Iy.Электрофорез

В плазме крови человека содержится 65-85 г/л белка, представленного различными про своему происхождению и свойствам фракциями. При различных острых и хронических заболеваниях, а также в результате действия многих повреждающих факторов внешней среды, таких как тяжелые металлы, окислители, органические растворители, хлорпроизводные, фосфорорганические соединения, вибрация, ультразвук и т.д. происходит изменение содержания в крови не только общего белка, но и белковых фракций (диспротеинемия). Выявление таких изменений имеет существенное клинико-диагностическое значение.

В разделении белковых фракций сыворотки крови основное значение принадлежит электрофорезу. Принцип этого метода основан на способности заряженных частиц (в том числе белков) перемещаться под действием электрического поля в зависимости от знака их заряда.

Скорость движения частиц в электрическом поле зависит от:

1. величины суммарного заряда частиц

2. размера и формы частиц

3. силы электрического тока и напряжения

4. свойств носителя, на котором проводят разделение

5. рН буферного раствора

6. температуры.

Виды электрофореза:

1. По направлению движения частиц основными являются два вида электрофореза горизонтальный и вертикальный.

2. По приборному оформлению:

- на пластинках;

- в трубочках

- в колонках

- капиллярный

3. По используемому носителю:

- на бумаге;

- на ацетатцеллюлозных мембранах;

- в геле (крахмальном, агарозном, полиакриламидном);

- без поддерживающей среды.

4. По интенсивности электрического поля:

- низковольтный (при используемом напряжении < 500 В)

- высоковольтный (при напряжении > 500 В)

Техника электрофореза впервые была предложена Тизелиусом в 1937 году.

Для проведения электрофореза требуются: источник постоянного тока и камера, заполненная буфером. Камера состоит из двух сообщающихся отделений: в одном находится электрод, в другом – конец поддерживающей среды, на которую наносится исследуемый материал (сыворотка крови).

Выбор буферного раствора определяется характером заряда исследуемых веществ. Для разделения сывороточных белков используют буферы с рН=8,6 (например, мединал-вероналовый). При такой величине рН молекулы белка заряжены отрицательно и их движение направлено к аноду.

В качестве поддерживающей среды для электрофореза используются:

1. Фильтровальная бумага: разделение проводится при низком напряжении поля, поэтому длится 16-18 часов, границы между отдельными фракциями получаются нечеткими, можно получить 5 основных белковых фракций сыворотки крови.

2. Пленки из ацетатцеллюлозы: дорогостоящие, разделение занимает меньше времени (30-40 минут), более эффективно. Получают также 5 фракций.Широко применяется для разделения и идентификации липопротеинов, изоферментов, гемоглобинов и для разделения белков мочи

3.Агар или агарозный гель представляют собой гетерополисахариды, менее дорогостоящие, чем ацетатцеллюлозные пленки, по эффективности не уступают им, разделение занимает около 90 минут; используются также при иммуноэлектрофорезе.

4. Крахмальный гель: обладает всеми преимуществами других гелей, характерен эффект молекулярного сита; используется, в основном , для предварительного разделения смеси белков.

5. Полиакриламидный гель: наиболее широко применяется; обладает высоким эффектом молекулярного сита; высокая эффективность разделения; можно получить до 20 белковых фракций сыворотки крови и более.

Этапы электрофореза:

1. Смоченную в буфере поддерживающую среду (носитель) помещают в камеру, заполненную буфером, и наносят на нее исследуемые пробы.

2. Подключают электроды и пропускают электрический ток и в течение определенного времени (зависит от поддерживающей среды) проводят разделение.

3. Фиксация проб с помощью ацетона, метанола или высокой температуры.

4. Окрашивание проб с помощью красителей (амидо черный, бромфеноловый синий, пунцовый S).

5. Удаление избытка красителя. Промывка электрофореграмм.

6.Определение процентного содержания фракций белка

- Сканирование электрофореграмм с помощью денситометра. В денситометре свет проходит через гель, поглощение света прямопропор-ционально количеству белка.

- Еще одним методом является элюирование окраски из основы с последующим колориметрическим измерением поглощения растворов. Но этот метод более трудоемкий и менее точный, и в настоящее время не используется в клинической практике.

7. Оценка полученных результатов.

В сыворотке крови человека в норме содержится альбумины – 55-65%; глобулины a₁-2-5%; глобулины a₂ –6-11%; глобулины b -11-15%; глобули-

ны g - 15-22%.