- •Введение
- •Тема 1: Строение и свойства аминокислот. Методы исследования аминокислот.
- •7. Этапы занятия и контроль их усвоения
- •Тема 2: Структурная организация белковых молекул. Методы количественного определения белка.
- •7. Этапы занятия и контроль их усвоения
- •Количественные методы определения белков
- •Лабораторная работа №2
- •Основные понятия фотоколориметрии
- •Устройство и принцип работы фотоэлектроколориметра
- •Тестовый контроль по теме « Строение белковой молекулы»
- •Тема 3 Физико-химические свойства растворов белков. Диализ. Осадочные реакции. Разделение смеси белков методом электрофореза.
- •2. Цель занятия:
- •3. Конкретные задачи:
- •5. Задание для самоподготовки:
- •Практическое применение осадочных реакций
- •Лабораторная работа № 3
- •Реактивы и оборудование
- •II.Диализ
- •III. Фракционное высаливание белков. Разделение альбуминов и глобулинов
- •Iy.Электрофорез
- •Осадочные пробы на белок
- •Тема 4: "Изучение свойств и биологической роли витаминов водорастворимой группы. Методы исследования свойств витаминов и количественного определения витамина с.
- •6. Вопросы для самоподготовки:
- •Лабораторная работа № 4 Количественное определение витамина с (аскорбиновой кислоты) в пищевых продуктах и в моче по методу Тильманса
- •Определение содержания витамина «с» в хвое и свежей капусте.
- •Определение содержания витамина «с» в сыром и вареном картофеле и в квашеной капусте.
- •Содержание витамина «с» в различных продуктах и моче
- •Тестовый контроль по теме « Витамины»
- •Установите строгое соответствие
- •3. Конкретные задачи.
- •4. Мотивация.
- •6. Вопросы для самоподготовки:
- •Специфичность действия ферментов
- •Тема 6: "Активация и ингибирование ферментов.
- •3. Конкретные задачи.
- •Лабораторная работа №6 Количественное определение активности сывороточной холинэстеразы. Изучение ингибирующего действия карбофоса и активирующего действия ионов кальция.
- •Клиническое значение определения активности сывороточной хэ.
- •Количественное определение активности тканевых дегидрогеназ и изучение действия их ингибиторов
- •Применение метода в санитарно-гигиенических исследованиях
- •Количественное определение активности дегидрогеназы янтарной кислоты (сукцинатдегидрогеназы, к. Ф. 1.3.99.1) тетразолиевым методом
- •Определение общей активности лактатдегидрогеназы (к.Ф. 1.1.1.27) и ее изоферментов.
- •Клиническое значение определения активности лактатдегидрогеназы.
- •Методы определения активности ферментов
- •Тест 12
- •Тест 13
- •Тест 14
- •Тест 15
- •Тема 7: "Энзимодиагностика и энзимотерапия. Клинико-диагностическое значение определения белкового спекра крови."
- •Тема 8 Программа контрольной работы по теме «Химия белков и ферментов. Витамины».
- •195067, Санкт-Петербург, Пискаревский пр.,д. 47
- •394019, Г. Воронеж, ул. Еремеева, 22ж
Применение метода в санитарно-гигиенических исследованиях
Метод определения активности дегидрогеназ может быть использован в гигиенических исследованиях при производственных и пищевых отравлениях окислителями, солями тяжелых металлов, алкилирующими агентами. Активность дегидрогеназ определяется при экспериментальных и клинических исследованиях, направленных соответственно либо на изучение биохимических механизмов действия на организм химических и физических факторов среды (ионизирующая и ультрафиолетовая радиация, шум, вибрация), либо на выявление признаков интоксикаций и других заболеваний.
Количественное определение активности дегидрогеназы янтарной кислоты (сукцинатдегидрогеназы, к. Ф. 1.3.99.1) тетразолиевым методом
ЦЕЛЬ РАБОТЫ: освоить метод количественного определения сукцинатдегидрогеназы . Исследовать действие ингибиторов на ее активность (УИРС).
Принцип метода: В результате окисления янтарной кислоты образуется фумаровая кислота и восстановленный ФАД.
COOH COOH
CH2 ФАД « ФАД·2Н CH
½ <――――――― ½½
CH2 сукцинатдегидрогеназа CH
COOH COOH
янтарная кислота фумаровая кислота
Водород, отщепляемый от субстрата дегидрогеназой, восстанавливает бесцветную соль тетразолия в яркоокрашенное соединение формазан.
Активность фермента характеризуется величиной оптической плотности раствора формазана, эквивалентного количеству отщепленного от субстрата водорода ферментом (ФАД·2Н) за 1 с в расчете на 1 г ткани, т. е. катал на 1 г ткани.
Реактивы и оборудование: 1. Раствор сукцината натрия 1,2% на фосфатном буфере, рН 7,0. 2. Раствор трифенилтетразолий хлорида 0,12%. 3. Растворы CdCl2, H2O2, СН2IСООН 0,01 М. 4. Ацетон. 5.Фотоэлектроколори-метр.
Ход работы: свежий мозг мыши измельчают ножницами на кусочки массой около 20 мг. Навеску мозга 20 мг помещают в каждую из 4 пробирок и отмеривают по 1 мл 0,12% раствора тетразолия хлорида. В первую пробирку добавляют 2 капли дистиллированной воды, во вторую, третью и четвертую пробирки - по 2 капли ингибитора (CdCl2, H2O2, СН2IСООН). Все пробирки оставляют при комнатной температуре на 20 мин. Затем во все пробирки добавляют по 1 мл 1,2% раствора сукцината натрия. Пробы инкубируют в термостате при температуре 38°С в течение 30 мин. Раствор из пробирок сливают, кусочки ткани стеклянной палочкой осторожно переносят в сухую пробирку и экстрагируют формазан 3 мл ацетона в течение 30 мин. Ацетоновый раствор формазана переносят в кювету с рабочим расстоянием 5 мм, и пробы колориметрируют на ФЭКе, используя синий светофильтр, (=490 нм). Активность фермента выражают в каталах, рассчитывая по формуле .
A=C/(B· t) = моль/(с · г ткани) = кат/г· ткани,
где С - концентрация восстановленного ФАД 2Н в молях (получена при использовании калибровочного графика); t - время инкубации в секундах; В - масса ткани в граммах.
Данные анализа и выводы: