7. Этапы занятия и контроль их усвоения

N п\п	Этапы проведения занятия	Формы проведения	Время (мин.)
7.1	Постановка задачи.	Излагает преподаватель.	5
7.2	Разбор теоретического материала.	Опрос студентов. Студенты пишут на доске формулы ами-окислот и пептидов обсуждают свойства аминокислот.	90
7.3	Приобретение практических навыков Выполнение практической части занятия, оформление про-токолов работы и подписание протоколов преподавателем.		70
7.4	Подведение итогов занятия. Задание на дом	Излагает преподаватель.	5

Лабораторная работа № 1

Цветные реакции на белки.

Цель работы: используя цветные реакции на белки, обнаружить белок в растворе. Открыть функциональные группы исследуемых аминокислот. УИРС ¾ на основании полученных данных сделать заключение об амино-кислотном составе и полноценности двух белков - яичного и желатины.

Проведение цветных реакций основано на образовании окрашенных соединений в результате взаимодействия того или иного реактива с опреде-ленными функциональными группами, входящими в состав молекулы белка.

Существует два типа цветных реакций:

1. Универсальные – биуретовая (характерна для всех белков и доказы-вает наличие пептидной связи) и нингидриновая (определяет наличие NH₂ – группы в a - положении у аминокислот и белков):

2. Специфические реакции, характерные для отдельных аминокислот, содержащих специфические функциональные группы.

Универсальные реакции на белки.

Биуретовая реакция. В результате взаимодействия ионов двухва-лентной меди с пептидными связями в щелочной среде образуется комп-лексное соединение, окрашенное в красно-фиолетовый цвет. Название реак-ции обословлено тем, что биурет (продукт конденсации двух молекул моче-вины NH_2-CO-NH-CO-NH₂ в аналогичных условиях дает такой же комплекс.

пептидные связи в биуретовый

енольной форме комплекс

Проведение реакции: к 4-5 каплям раствора белка добавляют 5 капель 10% раствора NaOH и 1 каплю (избыток мешает чтению результатов реак-ции!) 1% раствора CuSO₄. Так же проводят реакцию с желатиной.

Специфичность реакции: реакцию дают все соединения, содержащие в молекуле две и больше двух близко расположенных пептидных связей. Реакция характерна для всех белков (как полипептидов), но не специфична для них.

Реакция с нингидрином основана на его взаимодействии со свобод-ной аминогруппой.

Механизм реакции: нингидрин, являясь сильным окислителем, вызыва-ет отщепление аминогруппы с образованием свободного аммиака, СО₂, аль-дегида и восстановленной формы нингидрина. Восстановленная форма нин-гидрина, реагируя с аммиаком и избытком нингидрина, дает продукт конден-сации фиолетового цвета.

Проведение реакции: к 4-5 каплям раствора белка добавляют 5 капель раствора нингидрина и длительно (5-10 мин) нагревают на кипящей водяной бане. Присутствующий аммиак должен быть удален из системы. Аналогич-ным образом проводят реакцию с желатиной.

Специфичность реакции: в реакцию вступают белки, пептиды, свобод-ные аминокислоты и их производные, имеющие свободную амино группу в -положении.

Специфические реакции на отдельные аминокислоты и аминокислоты, входящие в состав молекулы белка или полипептида

Ксантопротеиновая реакция происходит при условии наличия в молекуле белка радикалов циклических аминокислот.

Механизм реакции: при действии на белок концентрированной азотной кис-лоты (белок при этом выпадает в осадок ¾ см. раздел «Денатурация белков») происходит нитрование циклических (содержащих бензольное кольцо) ради-калов аминокислот и образование нитропроизводных, окрашенных в желтый цвет. При подщелачивании окраска усиливается.

Молекула тирозина динитропроизводное хиноидное

в пептидной цепи тирозина производное тирозина

Проведение реакции: к 4-5 каплям раствора белка добавляют 2-3 капли концентрированной азотной кислоты. Образуется осадок белка, который при осторожном нагревании на водяной бане окрашивается в желтый цвет. К ох-лажденной (!) пробе добавляют избыток аммиака – появляется оранжевое ок-рашивание. Аналогичным образом проводят реакцию с желатиной.

Специфичность реакции: реакцию дают соединения, имеющие бен-зольные кольца в молекуле.

Реакция на аргинин (реакция Сакагучи) обусловлена образованием в щелочной среде ярко-красного продукта конденсации гуанидиновой груп-пировки с a - нафтолом.

+

аргинин a - нафтол

+ NH₃

хиноидный аммиак

комплекс

Выделяющийcя при реакции аммиак разлагается гипобромитом:

2NH₃+ 3NaBrO → N₂+3H₂O+3NaBr

Проведение реакции: к 4-5 каплям раствора белка добавляют равный объем 10% раствора NaOH и 3 капли спиртового раствора a - нафтола. После перемешивания добавляют 2-3 капли 2% раствора NaBrO. Появляется малиново-красное окрашивание. Так же проводят реакцию с желатиной.

Специфичность: реакция характерна для соединений, содержащих гуанидиновую группировку.

Реакция на слабосвязанную серу (реакция Фоля). При наличии в молекуле белка или пептида сульфгидрильных (тиоловых) групп SH ще-лочной гидролиз приводит к отщеплению серы в виде сульфида и при до-бавлении ионов Pb⁺² к образованию черного осадка PbS.

1. + 2NaOH →

+Na₂S + H₂O

2. (CH₃COO)₂Pb + 4 NaOH → Na₂PbO₂ + 2CH₃COONa + 2 H₂O

3 . Na₂S + Na₂PbO₂ + CH₃СOOH PbS¯ + CH₃COONa

сульфид свинца

черного цвета

Если в реакцию включаются дисульфидные группы остатков цистеина, то они должны вначале подвергнуться восстановительному расщеплению.

Проведение реакции: при добавлении к нескольким каплям раствора ацетата свинца избытка 10% раствора гидроксида натрия образуется щелоч-ной раствор плюмбита натрия. К нему приливают несколько капель раствора белка. Смесь нагревают на кипящей водяной бане. Раствор окрашивается в темно бурый цвет. Так же проводят реакцию с желатиной.

Специфичность реакции: реакция характерна для соединений, содер-жащих тиоловые группы.

Результаты лабораторной работы

Наименование Реакций	Субстрат	Окра- шива-ние	Чем обусловлена реакция
Биуретовая Нингидриновая Ксантопротеино-вая Реакция Фоля С a -нафтолом (Сакагучи)	а) яичный белок б) желатина а) б) а) б) а) б) а) б)

Вывод:

Клинико – диагностическое значение цветных реакций.

1. Цветные реакции используют для диагностики заболеваний, при которых происходит

- наследственное нарушение метаболизма отдельных аминокислот (фенилкетонурия, гомоцистинурия – методы смотри ниже).

- усиленный распад тканевых белков (злокачественные новообразования, гипертиреоз, ожоги).

- нарушение реабсорбции аминокислот в почках.

2. С помощью цветных реакций можно оценить качественный и коли-чественный состав белков и пептидов в биологических жидкостях, а также полноценность белков в пищевых продуктах.

3. В санитарно-гигиенической практике цветные реакции используют для количественного и качественного определения белковых веществ (загрязне-ний) во внешней среде (атмосферном воздухе, сточных водах и т.д.).

Скрининг – тесты для выявления наследственных и приобретенных нарушений белкового обмена.

Обнаружение цистина и гомоцистеина.

Ход исследования: каплю мочи наносят на фильтровальную бумагу и после высушивания добавляют одну каплю азида натрия. В течение 5 минут наблюдают за исчезновением бурой окраски. Исчезновение бурой окраски через 2-3 минуты после добавления азида натрия указывает на нормальные величины.

Клинические значения: тест положителен при наследственной гомоцис-тинурии (дефицит синтеза фермента цистатионинсинтетаза) или приобретен-ной (дефицит витаминов В₆, В₁₂, фолиевой кислоты), в этом случае окраска остается более 5 мин.

Для диагностики заболеваний белкового обмена также используют скрининг - тесты на обнаружение кетокислот, так как нарушения обмена аминокислот сопровождаются образованием и накоплением соответсвующих кетокислот и экскрецией их с мочой в большом количестве.

Обнаружение кетокислот (проба с треххлористым железом). К 0,5 мл мочи добавляют 0,25 мл раствора треххлористого железа. О наличии кето-кислот судят по характеру окраски (проба положительна); сине-зеленое окра-шивание указывает на наличие фенилпировиноградной кислоты, а желтое – на избыток пирувата в моче.

Обнаружение кетокислот по реакции с 2,4 – динитрофенилгидразином. Смешивают 1 мл раствора 2,4 ДНФГ и 0,25 мл мочи. При положительной пробе развивается окраска от желтой до оранжево-коричневой. В норме про-ба отрицательная, окраска не развивается.

Разделение смеси аминокислот методом распределительной хроматографии на бумаге.

Хроматография – это метод разделения компонентов смеси между двумя несмешивающимися фазами. Одной из них является неподвижная фаза, ко-торая бывает твердой, жидкой или представляет собой смесь твердой и жид-кой фаз. Вторая, подвижная фаза, может быть жидкой или газообразной; она обычно течет по неподвижной фазе или пропускается через нее. Поэтому в зависимости от агрегатного состояния фаз хроматографию разделяют на жидкостную, газовую и газожидкостную.

В зависимости от природы адсорбента и механизма разделения веществ, хроматография бывает нескольких видов:

- адсорбционная – основана на различной способности отдельных компо-

нентов смеси адсорбироваться на поверхности твердой фазы сорбента; этот метод предложен М.С.Цветом в 1903 г.

- распределительная – основана на различной растворимости разделяемых веществ в двух мало смешивающихся жидкостях

- ионообменная – основана на различной способности разделяемых

веществ к обмену их ионов на ионы неподвижной фазы

- осадочная – основана на образовании трудно растворимых осадков в

определенной последовательности

- диффузионная – основана на разделении веществ по скорости диффузии внутрь сорбента в зависимости от размера молекул неподвижной фазы ( к данному типу относится гель-фильтрация)

- аффинная – основана на сродстве компонентов смеси к лигандам неподвижной фазы.

Хроматографические методы анализа различают и по технике выпол-нения: колоночная (используется для разделения высокомолекулярных соединений), капиллярная, плоскостная (на бумаге или в тонком слое силика-геля). По направлению движения растворителя (подвижной фазы) различают восходящую, нисходящую, двухмерную и радиальную.

Для разделения аминокислот используют бумажную, нисходящую,

распределительную хроматографию.

Принцип метода: отдельные аминокислоты обладают различной растворимостью в двух частично смешивающихся жидкостях, одной из которых является вода, другой – водонасыщенный органический раство-ритель. Более гидрофобная аминокислота лучше растворяющаяся в непо-лярном растворителе, движется с большей скоростью от линии старта, чем гидрофильная аминокислота. В результате этого смесь аминокислот по окончании хроматографического разделения оказывается на разном расстоянии от линии старта.

Этапы работы.

На полоске хроматографической бумаги проводят линию старта, отступив от края на 3-5 см. Используя капилляр на линию старта наносят небольшое количество (1-2 капли) исследуемых растворов аминокислот и растворы «свидетели» (известных аминокислот). После нанесения раство-ров, бумагу просушивают на воздухе в течении 10 мин.Для проведения нисходящей хроматографии используется камера, состоящая из двух отсеков. В один отсек наливают растворитель (смесь бутанол ^_ уксусная кислота – вода, 15:10:10), в другой отсек помещают хроматограмму, таким образом чтобы конец бумаги на котором нанесены растворы аминокислот был погру-жен в растворитель.

Хроматографию проводят при комнатной температуре. Растворитель поднимается по бумаге, увлекая за собой аминокислоты, с большей ско-ростью в гидрофобной фазе двигаются аминокислоты с более гидрофобным радикалом. Когда растворитель дойдет до почти до края бумаги ее выни-мают и для фиксации пятен аминокислот высушивают в сушильном шкафу при температуре 105 градусов в течение 5 минут с целью устранения раство-рителя и фиксации аминокислот. Для выявления пятен аминокислот хрома-тограмму окрашивают 0,2% раствором нингидрина и вновь высушивают при температуре 90-100⁰в течении 5 минут. Для каждой аминокислоты рассчи-тывают коэффициент распределения Rf по формуле: Rf = a / b, где

а – расстояние в миллиметрах от линии старта до середины пятна (расстояние пройденное аминокислотой), b –расстояние в миллиметрах от линии старта до фронта растворителя. Сравнивают коэффициенты распре-деления «свидетелей» и аминокислот исследуемой смеси для качественного анализа исследуемой жидкости.

Для количественного анализа аминокислот каждое пятно вырезают и элюируют (вымывают) подходящим растворителем; затем проводят коли-чественный колориметрический анализ, либо хроматограмму помещают в фотометр для определения интенсивности окрашивания пятна в проходящем или отраженном свете.