Определение общей активности лактатдегидрогеназы (к.Ф. 1.1.1.27) и ее изоферментов.

Лактатдегидрогеназа (L-лактат; НАД-оксидоредуктаза) - гликолитический (цитозольный цинксодержащий) фермент (молекулярная масса 135 000 Д), обратимо катализирующий окисление L-лактата в пировиноградную кислоту. Окисленный никотинадениндинуклеотид используется в качестве кофермента и является акцептором водорода.

Схема реакции:

CH₃CHOHCOOН HAД⁺ <―――――――――> CH₃COCOOН+ HAД·H+H⁺

лактат лактатдегидрогеназа пируват

Фермент широко распространен в организме человека. По степени убывания активности энзима органы и ткани могут быть расположены в следующем порядке: почки, сердце, скелетные мышцы, поджелудочная железа, селезенка, печень, легкие, сыворотка крови. В последней обнаружено несколько различных изоферментов, обладающих одинаковыми каталитическими свойствами. Каждый из изоферментов представляет собой тетрамер, образованный субъединицами Н (heart) и М (muscle). Полипептидная цепь обеих субъединиц содержит 330 аминокислотных остатков; различия в их последовательности в субъединицах обнаружены на протяжении более чем 25% длины полипептидной цепи. Свойства ферментов ЛДГ определяются особенностями входящих в них субъединиц. Изменения в строении белковой части изоферментов обусловливают их различные физико-химические свойства (в частности, неодинаковую электрофоретическую подвижность). В плазме (сыворотке) крови выявлено пять изоферментов лактатдегидрогеназы ЛДГ₁ (HHHH) - 14-26%, ЛДГ₂ (НННМ) - 29-39%, ЛДГ₃ (ННММ) - 20-26%, ЛДГ₄ (НМММ) - 8-16%, ЛДГ₅ (ММММ) - 6-16%. Они располагаются в геле в порядке убывания электрофоретической подвижности.

Субъединица М обнаруживается главным образом в тканях с анаэробным метаболизмом, в то время как субъединица Н присутствует в тканях с преобладанием аэробных процессов. Изофермент ЛДГ₁ осуществляет окисление лактата в пируват в тканях с аэробным типом метаболизма (миокард, мозг, почки, эритроциты, тромбоциты), а ЛДГ₅, напротив, пирувата в лактат в тканях с высоким уровнем гликолиза (скелетные мышцы, печень).

Шестой изофермент лактатдегидрогеназы (ЛДГ-Х) встречается в яичках взрослых особей наряду с пятью изоферментами, которые обнаруживаются в других тканях. ЛДГ-Х является тетрамером, состоящим из 4 идентичных Х-субъединиц, которые отличаются по аминокислотному составу от Н- и М-субъединиц. Этот изофермент, видимо, связан со сперматогенезом, так как 80% активности лактатдегидрогеназы сперматозоидов обусловлено этим изоферментом.

Методы определения общей активности ЛДГ подразделяются на две основные группы: 1) кинетические, базирующиеся на оптическом тесте Bap6ypга (оптическом эффекте, связанном с превращением НАД⁺ в НАД • Н, и наоборот); 2) методы, в которых определяется количество образовавшегося продукта или потребляемого субстрата после фиксированного инкубационного периода (методы конечной точки).

Для изучения изоферментного спектра лактатдегидрогеназы используются способы, базирующиеся на:

-фракционировании методом зонального электрофореза или хроматографии (изоферменты ЛДГ нумеруются соответственно электрофоретической подвижности по отношению к аноду) с последующим тетразольным окрашиванием фракций и денситометрическим учетом картины разделения;

- дифференцированном неселективном и селективном ингибировании изоферментов ЛДГ: пируватом (ЛДГ₁ более чувствительна к его влиянию, чем ЛДГ₅), лактатом, оксалатом (более ингибирует ЛДГ₁, чем ЛДГ₅), мочевиной (инактивирует ЛДГ₅);

- различии в тепловой стабильности изоферментов (ЛДГ₁ ) различии в тепловой стабильности изоферментов

- применении антител (к ЛДГ₁ и ЛДГ₅): иммунохимические тесты и некоторые другие.