Лабораторная работа №2

1. Биуретовый метод (унифицированный метод). Принцип метода: белок реагирует в щелочной среде с сульфатом меди, при этом образуются соединения, окрашенные в фиолетовый цвет (биуретовая реакция). Оптичес-кая плотность окрашенного раствора прямо пропорциональна концентрации белка в сыворотке и определяется колориметрически.

Материал для исследования - сыворотка крови. Расчет ведут по калибровочному графику или методом сравнения с эталонным раствором белка. Нормальные величины 65-85 г/л. Метод специфичен, отличается хорошей воспроизводимостью. На правильность метода влияет качество калибровочного материала. Некоторые вещества оказывают интерферирую-щее действие в данной реакции: билирубин при концентрации больше 85 мкм/л, триглицериды больше 11,4 ммоль/л.

	Опыт (плазма)	Калибровочная проба	Контрольная проба
Калибратор	-	20 мкл	-
Проба	20 мкл		-
Вода			20 мкл
Рабочий реагент	1000 мкл	1000мкл	1000 мкл

Перемешать, выдержать 15 мин при комнатной температуре. Измерить оптическую плотность опытной (Dоп) и калибровочной (Dк) проб против контрольной пробы. Светофильтр 550 (540-570) нм. Концентрацию белка в пробе (г/л) рассчитать по формуле: С = Dоп/Dк * 70 г/л; С =

Где 70 – концентрация белка в калибровочной пробе (г/л)

Вывод

2. Метод Лоури

Количественное определение белка в сыворотке крови по методу Лоури.

Принцип метода Лоури: основан на развитии фиолетовой окраски раствора белка в результате двух реакций: 1) реакции белка с медью в щелочной среде; 2) последующего восстановления фосфомолибденово-фосфовольфрамового реагента комплексом белка с медью, что ведет к усилению окраски, развившейся в результате предыдущей реакции.

Расчет содержания белка проводят по калибровочному графику. Метод Лоури более чувствителен, но сложен по приготовлению основного раствора и менее специфичен.

Реактивы. 1. Щелочной реактив (А): смесь 2% раствора Na₂CO₃ в 0.1н NaOH и 0.5% раствора CuSO₄ в 1% растворе калий-натрий тартрата в соотношении 49:1.

2. Реактив Фолина-Чиокальтео (Б): 100 г вольфрамовокислого натрия и 25 г молибденовокислого натрия растворяют в 700 мл воды. К раствору добавляют 50 мл Н₃PO₄ и 100 мл HCl. Смесь кипятят с обратным холодильником в течении 10 часов, добавляют 150 г сернокислого лития, 50 мл дистиллированной воды и 5 капель бромной воды. Смесь кипятят снова 15 минут, затем охлаждают и доводят объем до до 1 л.

Ход работы. К 1 мл раствора сыворотки крови (разведение 1: 200) добавляют 2 мл щелочного реактива (А). Параллельно с опытной пробой го-товят контрольную пробу, содержащую вместо сыворотки 1 мл дистил-лированной воды. Смеси энергично перемешивают и добавляют по 0.2 мл реактива Фолина-Чиокальтео (Б). Пробы снова перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 минут для развития окраски. Оптическую плотность определяют с помощью фотоэлектроколориметра с красным све-тофильтром (l=610 нм) в кюветах с рабочим расстоянием l=1 см против контрольного раствора.

Расчет. По калибровочному графику, построенному предварительно: D=f(C), определяют концентрацию белка в пробе. Рассчитывают концен-трацию белка в сыворотке крови по формуле:

Х= С*В/ V г/л

Х – концентрация белка в сыворотке крови г/л;

В – разведение сыворотки (200) ; V – объем пробы, (1 мл);

С - концентрация белка в пробе, определенная по калибровочному графику, мг/мл.

Результаты лабораторной работы:

D= С= мг/мл (по калибровочному графику)

Х= г/л

Вывод:

Клинико-диагностическое значение определение белка в плазме крови. В сыворотке крови здорового человека содержится 65 - 85г/л белка. В плазме крови за счет фибриногена белка на 2-4 г больше. Это – нормо-протеинемия. Изменение общего белка не являются специфическими, а отражают общий патологический процесс (воспаление, некроз, новооб-разования), динамику и тяжесть заболевания. Пониженная концентрация белка в крови - гипопротеинемия, повышенная - гиперпротеинемия. Измене-ния концентрации общего белка плазмы крови могут носить относительный и абсолютный характер. Так, нагрузка водой, гидремия приводит к относи-тельной гипопротеинемии.

Наиболее частые причины гипопротеинемии:

1. Недостаточное потребление белка с пищей и несбалансированный аминокислотный состав пищи (голодание, ограничение приема пищи у курильщиков, алкоголиков).

2. Нарушение переваривания и всасывания белковых компонентов пищи при хронических воспалительных заболеваниях желудочно-кишечного тракта (диспепсия, дизентерия, гастроэнтериты).

3. Понижение биосинтеза белка в печени (альбумина, фибриногена, части глобулинов) (хронические и острые гепатиты, циррозы, длительные воспалительные процессы и тяжелые тиреотоксикозы).

4. Врожденное отсутствие или недостаточное содержание какого-либо белка в плазме крови.

5. Потери белка при острых и хронических кровопотерях (кровотечениях).

6. Выделение белка (альбумина) с мочой при нефрозе и амилоидозе. Содержание белка при этом может снижаться до 25-30 г/л. Врожденный нефротический синдром проявляется протеинурией и отеками.

7. Понижение содержания белка в крови у женщин в период лактации и в последние месяцы беременности.

При уменьшении белка в плазме крови возникают гипопротеинемические отеки вследствие снижения онкотического давле­ния и задержки воды в тканях.

Абсолютная гиперпротеинемия - явление редкое. Стойкая гиперпротеинемия (до 120г/л и выше) отмечается при миеломной болезни (белки Бенс-Джонса) и при макроглобулинемии Вальденштрема в связи с возникновением патологичес­ких очагов синтеза белков. Незначительная гиперпротеинемия встре­чается при некоторых хронических воспалительных заболеваниях (хронический полиартрит).

В процессе выполнения лабораторной работы студенты приобретают практические навыки работы в лаборатории.

Построение калибровочного графика

1.Готовят стандартный раствор белка с концентрацией 1 мг/мл. Для приготовления стандартного раствора используют альбумин бычий, лиофилизированный.

2.Из стандартного раствора готовят путем разбавления серию рабочих растворов (обычно 5-7) с известной концентрацией белка (см. таблицу ).

Готовят не менее 3 параллельных проб для каждой концентрации белка.

Таблица 2.

№	Объем стандарт ного раствора альбуми на V, мл	Объем 154 мМ раствора NaCl V, мл	Концентра ция белка С, мг/мл	Оптическая плотность, D
0	0.0	1.0	0.00	Конт роль
1.	0.1	0.9	0.10
2.	0.2	0.8	0.20
3.	0.3	0.7	0.30
4.	0.4	0.6	0.40
5.	0.6	0.4	0.60
6.	0.8	0.2	0.80
7.	1.0	0.0	1.00

3.В подготовленные растворы (1-7), а также контрольную пробу (0), содержащую 1 мл физиологического раствора добавляют по 2 мл щелочного реактива, а затем после перемешивания 0.2 мл реактива Фолина-Чиокальтео. Пробы снова перемешивают и оставляют

при комнатной температуре на 30 минут.

4.Колориметрируют на фотоэлектроколориметре в кюветах с рабочим расстоянием 1 см с красным светофильтром (l=610 нм) против контрольной пробы.

5.Полученные растворы используют для построения калибровочного графика зависимости оптической плотности (D) от концентрации белка в растворе (С): D=f(C)

Метод дает хорошие результаты при соблюдении закона Бугера-Ламберта-Бера.

Перечень элементов УИРС.

1. Самостоятельное определение по калибровочному графику количества белка в пробе.

2. Самостоятельный расчет концентрации белка по формуле.

3. Сравнительная клиничес­кая интерпретация полученных данных.

4. Обоснованный вывод по результатам исследования