- •Введение
- •Тема 1: Строение и свойства аминокислот. Методы исследования аминокислот.
- •7. Этапы занятия и контроль их усвоения
- •Тема 2: Структурная организация белковых молекул. Методы количественного определения белка.
- •7. Этапы занятия и контроль их усвоения
- •Количественные методы определения белков
- •Лабораторная работа №2
- •Основные понятия фотоколориметрии
- •Устройство и принцип работы фотоэлектроколориметра
- •Тестовый контроль по теме « Строение белковой молекулы»
- •Тема 3 Физико-химические свойства растворов белков. Диализ. Осадочные реакции. Разделение смеси белков методом электрофореза.
- •2. Цель занятия:
- •3. Конкретные задачи:
- •5. Задание для самоподготовки:
- •Практическое применение осадочных реакций
- •Лабораторная работа № 3
- •Реактивы и оборудование
- •II.Диализ
- •III. Фракционное высаливание белков. Разделение альбуминов и глобулинов
- •Iy.Электрофорез
- •Осадочные пробы на белок
- •Тема 4: "Изучение свойств и биологической роли витаминов водорастворимой группы. Методы исследования свойств витаминов и количественного определения витамина с.
- •6. Вопросы для самоподготовки:
- •Лабораторная работа № 4 Количественное определение витамина с (аскорбиновой кислоты) в пищевых продуктах и в моче по методу Тильманса
- •Определение содержания витамина «с» в хвое и свежей капусте.
- •Определение содержания витамина «с» в сыром и вареном картофеле и в квашеной капусте.
- •Содержание витамина «с» в различных продуктах и моче
- •Тестовый контроль по теме « Витамины»
- •Установите строгое соответствие
- •3. Конкретные задачи.
- •4. Мотивация.
- •6. Вопросы для самоподготовки:
- •Специфичность действия ферментов
- •Тема 6: "Активация и ингибирование ферментов.
- •3. Конкретные задачи.
- •Лабораторная работа №6 Количественное определение активности сывороточной холинэстеразы. Изучение ингибирующего действия карбофоса и активирующего действия ионов кальция.
- •Клиническое значение определения активности сывороточной хэ.
- •Количественное определение активности тканевых дегидрогеназ и изучение действия их ингибиторов
- •Применение метода в санитарно-гигиенических исследованиях
- •Количественное определение активности дегидрогеназы янтарной кислоты (сукцинатдегидрогеназы, к. Ф. 1.3.99.1) тетразолиевым методом
- •Определение общей активности лактатдегидрогеназы (к.Ф. 1.1.1.27) и ее изоферментов.
- •Клиническое значение определения активности лактатдегидрогеназы.
- •Методы определения активности ферментов
- •Тест 12
- •Тест 13
- •Тест 14
- •Тест 15
- •Тема 7: "Энзимодиагностика и энзимотерапия. Клинико-диагностическое значение определения белкового спекра крови."
- •Тема 8 Программа контрольной работы по теме «Химия белков и ферментов. Витамины».
- •195067, Санкт-Петербург, Пискаревский пр.,д. 47
- •394019, Г. Воронеж, ул. Еремеева, 22ж
Лабораторная работа №6 Количественное определение активности сывороточной холинэстеразы. Изучение ингибирующего действия карбофоса и активирующего действия ионов кальция.
Различают два типа холинэстераз (ХЭ): ацетилхолинэстераза (АХЭ, истинная ХЭ, К.Ф.3.1.1.7) и бутирилхолинэстераза (сывороточная ХЭ, псевдохолинэстераза, К.Ф.3.1.1.8). Ферменты являются простыми белками, относятся к классу гидролаз и подклассу эстераз.
Ацетилхолинэстераза - фермент, катализирующий расщепление ацетилхолина на одноатомный азотсодержащий спирт холин и уксусную кислоту, содержится в мозгу, печени, почках, мышцах, эритроцитах и других тканях. Ацетилхолин участвует в передаче нервных импульсов в качестве химического медиатора в синапсах центральной и периферической нервной системы, выделяясь в синаптическую щель в момент проведения импульса. Его ферментативное расщепление необходимо для подготовки постсинаптической мембраны к проведению нервного импульса. Ацетилхолинэстераза нервной ткани связана с наружной стороной постсинаптической мембраны, состоит из однородных глюкопротеидных субъединиц, чаще из четырех. Система «ацетилхолин-холинэстераза» участвует в регуляции возбудимости и сократимости гладкой и сердечной мышц, в осуществлении процессов активного и пассивного переноса ионов через мембраны эритроцитов и мышц.
Холинэстераза в основном содержится в печени, поджелудочной железе, слизистой кишечника, легких и сыворотке. Возможно, что постоянное присутствие чрезвычайно активной ХЭ в плазме крови является защитным приспособлением и предотвращает распространение по тканям ацетилхолина при его попадании в кровяное русло.
Показано, что в небольших количествах ХЭ содержится и в центральной нервной системе. Существует предположение, что роль ХЭ нервной системы сводится к защите АХЭ от угнетающего действия таких эфиров холина, которые практически не разрушаются АХЭ, но могут образоваться в организме (пропионилхолин, бутирилхолин, валерилхолин и др.), а ХЭ их разрушает. Возможно также, что в отдельных участках мозга могут создаваться ненормально высокие концентрации ацетилхолина, избыток которого, как известно, тормозит АХЭ, но не влияет на активность ХЭ, которая его разрушает.
На активность фермента могут влиять специфические факторы: ингибиторы и активаторы. К специфическим необратимым ингибиторам ацетилхолинэстеразы относятся эфиры фосфорной кислоты: алкилфосфаты, фосфонаты, которые применяются в качестве инсектицидов, боевые отравляющие вещества – зарин, заман, табун, а также некоторые фармакологические препараты – армин, фосфакол, хлорофтальм. Обратимые ингибиторы – тетраалкиламмониевые соли: физостигмин, прозерин, эдрофоний. Активируют ацетилхолинэстеразу ионы кальция и магния.
По данным А. А. Покровского (1961), существует свыше 100 вариантов методов химического определения холинэстеразной активности в крови, в большинстве своем основанных на определении скорости образования уксусной кислоты (т. е. одного из продуктов реакции) и различающихся по способам этого определения. Методы делятся на манометрические, титриметрические, колориметрические и спектрофотометрические. Существует экспресс-метод определения активности ХЭ в сыворотке крови с использованием хроматографической бумаги, пропитанной ацетилхолином и индикатором, изменяющим окраску в зависимости от рН среды.
Цель работы освоить метод определения активности холинэстеразы. Изучить действие на активность холинэстеразы ингибиторов и активаторов.
Принцип метода: основан на смещении рН буферного раствора уксусной кислотой образующейся в результате гидролитического ферментативного расщепления ацетилхолина, что устанавливают с помощью индикатора.
Схема реакции:
Cl Cl
CH3COOCH2CH2N+(CH3)3 + H2O --------> CH3COOH + НOCH2CH2N+(CH3)3
Ацетилхолинхлорид АХ Э уксусная холинхлорид
кислота
Реактивы и оборудование:
1. Боратный буфер, рН 8,4. 2. Ацетилхолинхлорид 3% раствор. 3 .Индикатор фенолрот. 4. Кальций хлорид – 0,1 н раствор. 5. Карбофос - 1% раствор.
6. Дистиллированная вода. 7. Термостат 37°С. 8. Пробирки и пипетки для реактивов. 9. Фотоэлектроколориметр
Ход работы: В 4 пробирки отмеривают по 0,1 мл сыворотки крови, добавляют по 1 мл боратного буферного раствора рН=8,4. 3атем в соответствии с таблицей в пробирки добавляют дистиллированную воду, СаС12 и карбофос, перемешивают содержимое пробирок встряхиванием и оставляют на 5 мин. при комнатной температуре. Через 5 мин. в пробирки N 2,3,4 добавляют по 0,5 мл ацетилхолина и помещают все пробы в термостат при 37°С на 1 час.
N пробирок |
1 |
2 |
3 |
4 |
Сыворотка (мл) |
0,1 |
0,1 |
0,1 |
0,1 |
Буфер (мл) |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
Вода дист. (мл) |
1,0 |
0,5 |
― |
― |
СаС12 (мл) |
— |
— |
0,5 |
— |
Карбофос (мл) |
— |
— |
— |
0,5 |
Ацетилхолин (мл) |
― |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
Результаты эксперимента.
Плотность (Д) |
|
|
|
|
Д1 – Д 2,3,4 |
― |
|
|
|
Активность ХЭ ммоль/л·ч |
― |
|
|
|
После инкубации в каждую пробирку добавляют по 1,0 мл дистиллированной воды и по 2 капли раствора индикатора. Затем пробы колориметрируют на фотоэлектроколориметре с зеленым светофильтром (=540 нм) в кюветах с толщиной слоя жидкости 10 мм, в качестве контроля используют дистиллированную воду.
Результаты измерений вносят в таблицу. Из показателей абсорбции стандартной (1) пробы вычитают значения оптической плотности опытной (2,3,4). Рассчитывают активность ХЭ по калибровочному графику. Для построения калибровочного графика используют разведения 0,1 н уксусной кислоты с ее содержанием в пробе от 4 до 18 мкмоль в пробе, что соответствует активности ХЭ от 80 до 360 ммоль/(л·ч).
Активность ХЭ в сыворотке в норме составляет 160-340 ммоль/(л·ч).
Вывод: