Определение активности холинэстеразы в сыворотке крови колориметричес­ким методом

В организме человека существуют два типа холинэстераз:

1) ацетилхолинэстераза (АХЭ), которая встречается пре­имущественно в мозге, эритроцитах, мышцах, нервах: это субстратспецифический фермент, катализи­рующий гидролитическое расщепление ацетилхолина на холин и уксусную кислоту;

2) холинэстераза (ХЭ) содержится в основном в печени, поджелудочной железе и плазме крови, она обладает более широкой субстратной специфичностью, т. е. расщепляет ацетилхолин и другие эфиры холина. Активность ацетилхолинэстеразы сыворотки и тка­ней определяют при клинико-диагностических исследо­ваниях.

В норме ХЭ колеблется в широких пределах: 160— 340 мкмоль/(млч). Чаще всего при патологических со­стояниях активность ХЭ снижается. Значительное сни­жение активности ХЭ сыворотки крови отмечается при заболеваниях печени, гипотиреозе, бронхиальной астме, ожогах, отравлениях. Метод основан на количественном определении уксусной кислоты, образующейся из ацетил-холинхлорида в ферментативной реакции, катализируе­мой холинэстеразой сыворотки:

Ход работы. Готовят две пробирки для опытной и контрольной пробы. В опытную пробирку вносят 5 мл раствора вероналового буфера, содержащего индикатор феноловый крас­ный, 0,2 мл дистиллированной воды, 0,1 мл сыворотки крови. Смесь помещают в термостат при 37°С на 5 минут. Затем в пробу добавляют 0,2 мл раствора ацетилхолин хлорида и инкубируют в термостате при 37°С в течение 30 минут. После инкубации в пробу добавляют 0,2 мл раствора прозерина для прекращения ферментативной реак­ции. В контрольную пробу вносят сначала 0,2 мл раство­ра прозерина, а затем все реактивы по порядку, как в опыт­ной пробе.

После инкубации обе пробы колориметрируют на ФЭКе с зеленым светофильтром против воды. Окраска ус­тойчива в течение 1 часа. Находят разность между показате­лями ФЭКа для опытной и контрольной проб, затем по калибровочному графику определяют количество уксус­ной кислоты, образовавшейся в опыте.

Расчет активности холинэстеразы делают по форму­ле: активность холинэстеразы = а  10  2 мкмоль/(мл  ч), где а — содержание уксусной кислоты в пробе, мкмоль; 10 — коэффициент пересчета на 1 мл сыворотки; 2 — коэффи­циент пересчета на 1 ч инкубации.

Контрольные вопросы

1. Какие вещества способны проникать через гематоэнцефалический барьер? Их структурные формулы.

2. Напишите структурные формулы липидов, входящих в состав нервной ткани: цереброзидов, ганглиозидов, сфингомиелинов, фосфолипидов, ХС.

3. Какие пептиды участвуют в метаболизме нервной ткани? Состав их.

4. Напишите схему образования аммиака в нервной клетке («пуриновый» цикл). Укажите соответствую­щие ферменты.

5. Какие аминокислоты принимают участие в обмене в клетках нервной системы? Напишите схему, подтвер­ждающую обмен этих аминокислот.

6. Укажите биохимические основы возникновения: а) миастении;

б) шизофрении; в) депрессивных состо­яний.

7. Каков принцип определения каталитической актив­ности холинэстеразы в сыворотке крови?