Добавил:
Sekretar
kiopkiopkiop18@yandex.ru
t.me/Prokururor I Вовсе не секретарь, но почту проверяю
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Ординатура / Хирургия / Библиотека им академика М.И. Перельмана / Книга_4760_Библиотеки_им_академика_М_И_Перельмана
.pdf
71
При орофарингоскопии обращали внимание на цвет и состояние слизистой
оболочки преддверья рта, зубов, ротовой полости, глотки, языка. Тщательно
оценивали рaзмер нёбных миндалин, консистенцию, наличие патологического
содержимого в лакунах, наличие спаечного процесса паренхимы с передними
нёбными дужками.
При отоскопии оценивали состояние наружных слуховых проходов и
заушной области, цвет кожи, наличие или отсутствие патологического
отделяемого, его характер, консистенцию, опознавательные знаки барабанных
перепонок, проекции слуховых косточек. Оценку слуха выполняли путем
определения восприятия шепотной и разговорной речи. Углубленное
аудиологическое обследование проводили по показаниям.
При непрямой ларингоскопии оценивали состояние надгортанника, его
форму, цвет слизистой оболочки гортани, симметричность и подвижность
голосовых складок при фонации, положение и состояние грушевидных синусов.
2.5.4 Эндоскопическое исследование полости носа
Эндоскопический осмотр проводили с помощью оборудования Karl Storz и
ригидных эндоскопов уменьшенного педиатрического диаметра 2,7 и 3,0 (0°, 30°,
45°) и длиной 18 см, источником света Xenon 300 и видеокамерой Telecam SLII
(Karl Storz, Германия). При эндоскопической оценке состояния полости носа
использовали шкалы Lund–Kennedy. Параметры оценки были следующими:
наличие или отсутствие полипов, отека слизистой оболочки; отделяемого в
носовых ходах; рубцов; образование корок. При этом степень выраженности
симптомов оценивалась как: 0 — отсутствие, 1 — средние проявления, 2 —
выраженные проявления. Отдельно фиксировали данные с каждой стороны [198].
Перед оперативным вмешательством все дети осматривались врачом-
педиатром, по показаниям выполнялись консультации других специалистов.
https://t.me/medicina_free
72
2.5.5 Лучевые методы исследования
Всем пациентам выполнялось МСКТ-исследование околоносовых пазух
перед оперативным вмешательством и через 6 мес. Время выполнения
дооперационного обследования МСКТ было максимально приближено ко дню
операции и проводилось не ранее чем за 2 нед до хирургического вмешательства.
Использовался спиральный компьютерный томограф Somatom Emotion
(Siemens Medical Solutions, Германия) с HiRes и толщиной срезов 0,63 и 0,75 мм.
В полученных КТ-изображениях тщательно изучались полость носа,
околоносовые пазухи, и окружающие анатомические структуры, а также
оценивалась степень анатомического развития и пневматизации околоносовых
пазух и соответствие их возрасту ребенка.
Для адаптации к навигационному оборудованию использовали специальный
протокол МСКТ «Околоносовые пазухи», который включал шаг исследования до
0,5 мм, захват области головы от верхушки до нижней челюсти, режим
визуализации мягких тканей, контрастирование при необходимости. Отдельное
внимание уделялось четкой визуализации анатомических зон, значимых в
хирургическом аспекте, таких как расположение внутренних сонных артерий,
каналы зрительных нервов, особенности строения бумaжной, бaзaльной и
ситовидной плaстинок. Фиксировались зоны прохождения носослезного и
носолобного каналов, структуры остиомеaтaльного комплекса. Исследование
проводилось лежа на спине по стандартной укладке. По показаниям детям МСКТ
выполнялась под наркозом.
Оценку изменений компьютерных томограмм проводили с использованием
шкалы Lund–Mackay [308].
Изменения в околоносовых пазухах по результатам МСКТ оценивали как с
каждой стороны, так и суммарно с двух сторон. Параметры для анализа были
следующие: степень затемнения верхнечелюстной пазухи, передних решетчатых
клеток, задних решетчатых клеток, лобной пазухи, клиновидной пазухи;
блокировка остиомеатального комплекса. Также суммировали общее количество
https://t.me/medicina_free
73
баллов. Оценку производили по критериям: 0 — отсутствие патологии, 1 —
частичное затемнение, 2 — тотальное затемнение.
2.5.6 Методика определения активности мукоцилиарного транспорта слизистой
оболочки полости носа
Использовался метод прижизненной видеоцитоморфометрии [320]. Для
забора биологического материала применяли разработанную нами модификацию
инструмента для взятия пробы со слизистой оболочки полости носа (патент
№ 178267 U1) [23]. Преимуществами применения нашей модели явились
повышение информативности биопробы для оценки функциональной активности
цилиарного аппарата респираторного эпителия слизистой оболочки полости носа,
усовершенствование эргономики, а также снижение стоимости самого
исследования. Разработанный нами инструмент для взятия пласта клеток
слизистой оболочки полости носа для проведения видеоцитоморфометрии
представляет собой эластичный стержень и двустороннюю щетку с тремя
параллельными рядами полипропиленовых щетинок с длиной каждой щетинки
2 мм, длиной каждого ряда — 20 мм (рисунок 1, а).
а
б
Рисунок 1 — Инструмент для взятия пробы со слизистой оболочки носа (а)
и методика забора материала методом видеоцитоморфометрии (б).
https://t.me/medicina_free
74
Материал забирали со слизистой оболочки средней носовой раковины в
зоне проекции остиомеатального комплекса без предварительной анестезии и
(или) какой-либо обработки. Забор материала производили отдельно с правой и
левой половины полости носа. После введения щетки в течение 10 с проводили
вращательные движения по передней поверхности слизистой оболочки средней
носовой раковины с незначительным усилием для получения пласта клеток, но не
вызывая повреждение тканей и кровоточивость (рисунок 1, б).
Кончик щетки споласкивали в пробирке Эппендорфа с 0,5 мл 0,9%
изотонического раствора натрия хлорида, подогретого до 37 °C. Полученную
суспензию в объеме 50 мкл наносили на предметное стекло и накрывали
покровным. Визуальный анализ проводили на микроскопе Nikon Eclipse E200
(Nikon, Япония), дооснащенном фазовым контрастом и высокоскоростной
цветной камерой Basler (Basler AG, Германия). С каждого образца записывали по
5 видеороликов с частотой 120 кадров в секунду (fps) в верхней и боковой
проекциях относительно цилиарного аппарата. Для видеосъемки выбирали поля
зрения с площадью пласта клеток не менее 2500 мкм
2
или при боковой проекции
сохраненные ряды клеток длиной не менее 50 мкм. В дальнейшем проводили
морфометрический анализ каждого видеоролика в программе MMC Multimeter
(MMCSoft, Россия) с подсчетом относительного числа клеток с подвижными
цилиями (%), частоты биения цилий (в герцах), оценки клеточной выживаемости
(в минутах). Анализировали также количество клеток в образце с цилиарным
аппаратом (качественный показатель по убыванию от 1 до 3 баллов),
выраженность дистрофических повреждений клеток на световом уровне
(качественный показатель по убыванию от 1 до 3 баллов), характер расположения
клеток в образце (качественный показатель: 1 — пластами, 2 — разрозненно),
синхронность двигательной активности цилиарного аппарата (качественный
показатель: 1 — сохранена, 2 — нарушена, 3 — не оценить), характер нарушения
двигательной активности цилиарного аппарата (качественный показатель: 1 —
групповой асинхронизм, 2 — клеточный, 3 — смешанный).
https://t.me/medicina_free
75
Полученные результаты заносили в общую базу данных. Оставшийся
материал наносили на предметные стекла с помощью цитоцентрифуги Cyto-Tek
(Sakura, Япония) и окрашивали гематоксилином Гарриса по Папаниколау
(рисунок 2) и эозином метиленовым синим по Май–Грюнвальду–Гимзе.
1
2
а
2
1
б
Рисунок 2 — Микрофотография клеток респираторного эпителия слизистой
оболочки полости носа у ребенка в норме при фазовом контрастировании (а) и
окраске гематоксилином Гарриса по Папаниколау (б): 1 — ядро; 2 — цилиарный
аппарат. 400.
2.5.7 Лабораторные анализы крови
Для проведения стандартных клинических и биохимических анализов крови
производили забор цельной венозной крови из кубитальной вены пациента утром
натощак иглой с широким просветом. Кровь собирали в вакуумные пробирки с
антикоагулянтом ЕДТА-2К, ЕДТА-3К и ЕДТА-2Na, с которым смешивали
посредством переворачивания пробирки в течение как минимум 30 с. Взятые
образцы крови в специальном термоконтейнере доставляли в лабораторию.
Образец исследовали не позднее 4 ч после забора. Дальнейшие исследования
производили при температуре 18–23 °C.
https://t.me/medicina_free
76
Клинические анализы крови с полной дифференцировкой лейкоцитов и
определением содержания ретикулоцитов в цельной крови проводили на
аппарате — автоматическом гематологическом анализаторе SYSMEX XS1000
(Япония).
Определение СОЭ выполняли с использованием полностью
автоматического анализатора определения СОЭ венозной и капиллярной крови —
Roller 20PN (Alifax, Италия).
Биохимические исследования проводили на оборудовании COBAS
INTEGRA 400 (Roche Diagnostics GmbH, Германия) с определением
концентрации С-реактивного белка иммунотурбудиметрическим методом.
2.5.8 Определение содержания химических элементов в индикаторных
биосубстратах и биоптате слизистой оболочки полости носа и околоносовых пазух
2.5.8.1 Забор образцов индикаторных биосубстратов
Сбор образцов волос с затылочной части головы обследуемых проводили в
присутствии родителя (законного представителя) ребенка в количестве до 0,5 г.
Непосредственно для исследования были использованы лишь проксимальные
части прядей волос длиной 1–2 см, в значительно меньшей степени
подверженные загрязнению из окружающей среды. После сбора образцов их
хранили в бумажных конвертах при комнатной температуре непосредственно до
проведения анализа.
Забор образцов венозной крови из локтевой вены осуществляли натощак
утром с использованием пробирок S-Monovette (Sarstedt, Nümbrecht, Германия).
Для получения сыворотки, образцы крови центрифугировали в течение 10 мин
при 1800 об./мин. После центрифугирования образцы сыворотки отбирали в
пробирки типа Эппендорф для их последующего хранения при –40 °C до момента
проведения анализа.
https://t.me/medicina_free
77
Образцы патологически измененной слизистой оболочки полости носа и
околоносовых пазух были получены в процессе проведения эндоскопического
вмешательства при ХРС и хранились в пробирках Эппендорф при –40 °C до
момента проведения анализа.
2.5.8.2 Преаналитическая пробоподготовка
Полученные образцы волос предварительно промывали ацетоном с
последующим троекратным промыванием дистиллированной деионизированной
водой (18 МОм
см) (Labconco Corp., США). После отмывания образцы волос
высушивали на фильтровальной бумаге в вытяжном шкафу при комнатной
температуре до стабильного веса.
Впоследствии 50 мг образцов волос вносили в тефлоновые пробирки для
проведения микроволнового разложения с использованием системы Berghof SW-4
DAP-40 с частотой 2,46 ГГц и мощностью 1450 Вт (Berghof Products + Instruments
GmbH, Германия) в присутствии 5 мл высокоочищенной концентрированной
(65%) азотной кислоты (HNO
3
) (Sigma-Aldrich Co., США). Процедура
микроволнового разложения образцов включала 20-минутные циклы нагрева,
температурного воздействия при 170–180 °C и остывания. По окончании
процедуры разложения и остывания системы до комнатной температуры
полученные образцы вносили в полипропиленовые пробирки с последующим
доведением дистиллированной деионизированной водой до суммарного объема
15 мл.
Пробоподготовка образцов слизистой оболочки полости носа и
околоносовых пазух, полученных в процессе эндоскопической операции,
проводилась аналогичным способом за исключением процедуры отмывания.
Пробоподготовка сыворотки крови и цельной крови обследуемых
заключалась в разведении образцов в объемном соотношении 1:15 подкисленным
дилюентом с pH 2,0, включающим в итоговом растворе 8% 1-бутанол (#1.00988,
https://t.me/medicina_free
78
Merck KGaA, Германия), 0,1% Тритон X-100 (Sigma #T9284 Sigma-Aldrich, Co.,
США), 0,07% азотной кислоты (Fluka #02650 Sigma-Aldrich, Co., США),
приготовленным на дистиллированной деионизированной воде с удельным
сопротивлением 18,2 МОм
см (#9000602, Labconco Corp., США).
2.5.8.3 Анализ содержания эссенциальных химических элементов
в биологических образцах
Определение содержания эссенциальных химических элементов — кальция
(Ca), магния (Mg), железа (Fe), меди (Cu), кобальта (Co), марганца (Mn), хрома
(Cr), селена (Se) и цинка (Zn) — осуществлялось методом масс-спектрометрии с
индуктивно связанной аргоновой плазмой (ИСП-МС) на спектрометре NexION
300D (PerkinElmer Inc., США) [57], оснащенном автоматическим дозатором ESI
SC-2 DX4 (Elemental Scientific Inc., США). Режим динамической ячейки (dynamic
reaction cell, DRC) позволяет минимизировать большинство межатомных
интерференций в процессе анализа, что существенно повышает чувствительность
используемой ИСП-МС-системы.
Используемая для анализа ИСП-МС-система характеризуется мощностью
плазмы — 1500 Вт, скоростью потока аргоновой плазмы — 18 л/мин, скоростью
дополнительного потока аргона — 1,6 л/мин, скоростью потока образца —
637 мкл/мин, скоростью потока внутреннего стандарта — 84 мкл/мин. В качестве
системы внесения образца использованы концентрический небулайзер ESI ST
PFA (Elemental Scientific Inc., США) и циклоническая распылительная камера SI
PFA (Elemental Scientific Inc., США).
Предварительную калибровку системы осуществляли в ожидаемых
пределах концентраций химических элементов в образцах. Для калибровки
использованы растворы химических элементов с конечной концентрацией 0,5; 5,
10 и 50 мкг/л (нг/мл), приготовленные на основе сертифицированного набора
стандартов от производителя Universal Data Acquisition Standards Kit (#N9306225,
https://t.me/medicina_free
79
PerkinElmer Inc., США). Итоговая концентрация химических элементов в
калибровочных растворах достигалась посредством разведения исходных
растворов дистиллированной деионизированной водой, подкисленной
посредством внесения 1% HNO
3
(Fluka #02650, Sigma-Aldrich Co., США).
Учитывая различия в кислотности и вязкости калибровочных растворов и
анализируемых матриц, в процессе анализа проводили внутреннюю онлайн-
стандартизацию с использованием стандартных растворов иттрия (Y) и родия
(Rh) в итоговой концентрации 10 мкг/л, приготовленных на основе стандарта от
производителя Pure Single-Element Standard (#N9300167 и #N9300144, PerkinElmer
Inc., США). Итоговый раствор внутреннего стандарта для ИСП-МС-анализа
готовили на матрице, содержащей 8% 1-бутанол (#1.00988, Merck KGaA,
Германия), 0,8% Тритон X-100 (Sigma #T9284, Sigma-Aldrich Co., США), 0,02%
тетраметиламмония гидроксид (#20932, Alfa Aesar, Ward Hill, MA, США) и 0?02%
ЭДТА (Sigma #431788Sigma-Aldrich Co., США).
2.6 Контроль качества
В ходе анализа биологических образцов на содержание химических
элементов постоянно проводился контроль качества лабораторных исследований.
В частности, использованы сертифицированные референтные образцы волос
(GBW09101, Shanghai Institute of Nuclear Research, КНР), сыворотки крови и
цельной крови (ClinChek
®
, RECIPE Chemicals + Instruments GmbH, Германия).
Контроль качества анализа биоптатов слизистой оболочки полости носа и
околоносовых пазух проводился с использованием сертифицированного образца
печени (GBW 08551, Shanghai Institute of Nuclear Research, КНР). Стандартные
сертифицированные образцы проходили все этапы исследования наряду с
анализируемыми биообразцами, что позволяет свидетельствовать об отсутствии
потерь или загрязнения на всех этапах. В ходе анализа проводилась оценка
фактических значений, полученных во время анализа, сертифицированным,
заявленным производителем. Во всех случаях фактические значения находились в
https://t.me/medicina_free
80
пределах референтных интервалов, заявленных производителем, что указывает на
высокую чувствительность метода.
2.7 Статистический анализ полученных данных
Полученные данные подвергались статистической обработке с
использованием программного пакета Statistica 10.0 (Statsoft, США). Анализ
нормальности распределения данных осуществляли с использованием метода
Шапиро–Уилка. В качестве описательных статистик для данных,
характеризуемых распределением, отличным от гауссового, использованы
медиана и соответствующие границы межквартильного интервала (IQR), тогда
как в случае нормального распределения для представления данных
использованы средняя и соответствующие значения стандартного отклонения
(±SD). Качественные характеристики представлялись в виде относительного
количества случаев, характеризуемых соответствующим признаком, от общего
количества наблюдений (%). Сравнительный анализ зависимых переменных на
этапах наблюдения (до/после операции) осуществляли с использованием
критерия знаков (sign test). Для оценки достоверности отличий независимых
переменных при сравнении различных групп обследуемых использован U-
критерий Манна–Уитни с поправкой на множественные сравнения. Сравнение
категориальных показателей проводилось с помощью критерия хи-квадрат (χ
2
).
Для оценки взаимосвязи между двумя отдельными параметрами
использован коэффициент корреляции Пирсона с указанием соответствующих
значений р. Для сравнительной оценки взаимосвязи между зависимым
параметром и множеством независимых переменных (предикторов) использован
множественный линейный регрессионный анализ. Наряду с оценкой взаимосвязи
между отдельными независимыми предикторами (коэффициент регрессии,
значение р), также оценивалась предиктивная значимость модели (коэффициент
детерминации R
2
и р для модели).
https://t.me/medicina_free
Соседние файлы в папке Библиотека им академика М.И. Перельмана