Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Техника лабораторной работы с фитопатогенными микроорганизмами. Учебное пособие
.pdf
Ульяновский государственный аграрный университет
им. П.А. Столыпина
Кафедра «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-
санитарная экспертиза»
П.С. Майоров
ТЕХНИКА ЛАБОРАТОРНОЙ
РАБОТЫ С
ФИТОПАТОГЕННЫМИ
МИКРООРГАНИЗМАМИ
УЧЕБНОЕ ПОСОБИЕ
Ульяновск – 2025
УДК 579.64
ББК 28.4
Техника лабораторной работы с фитопатогенными микроорганизмами.
Учебное пособие / П.С. Майоров, — Ульяновск, 2025. — 388 с.
В учебном пособии собраны основные методологические аспекты
проведения лабораторных исследований ф области фитопатологии, целью
которого является формирование компетенций у обучающихся в учебных
организациях, реализующих программы высшего образования при освоении
общепрофессиональных и профессиональных компетенций направлений
подготовки: 06.03.01 — Биология, 06.04.01 — Биология.
Обсуждено и одобрено кафедрой микробиологии, вирусологии,
эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы (протокол № 2 от
22.10.2025 г.).
Печатается по решению Методического совета факультета ветеринарной
медицины и биотехнологии ФГБОУ ВО Ульяновский ГАУ (протокол № 2 от
27.10.2025 г.).
Рецензенты:
Феоктистова Н.А. — кандидат биологических наук, доцент кафедры
микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной
экспертизы ФГБОУ ВО Ульяновский ГАУ
© ФГБОУ ВО Ульяновский ГАУ, 2025.
3
ОГЛАВЛЕНИЕ
1. ТЕХНИКА БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ РАБОТЕ С ФИТОПАТОГЕННЫМИ
МИКРООРГАНИЗМАМИ .................................................................................... 15
1.1. Правила работы в бактериологической лаборатории ............................. 15
1.2. Лабораторные инструменты ...................................................................... 16
1.3. Общие прниципы работы в лаборатории ................................................. 19
2. ПОДТВЕРЖДЕНИЕ НАЛИЧИЯ ПАТОГЕНОВ БАКТЕРИАЛЬНОГО
ПРОИСХОЖДЕНИЯ В ПОРАЖЕННЫХ ОБРАЗЦАХ РАСТЕНИЙ .............. 21
2.1. Тест на слизь ............................................................................................... 21
2.2. Тест на молочную воду .............................................................................. 22
2.3. Тест на выделение бактериальной массы из растения ........................... 23
2.4. Путем окрашивания измельченной части больного растения ............... 23
3. ГИСТОПАТОЛОГИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ .................... 25
3.1. Определение локализации бактериальных патогенов в растение-хозяине
............................................................................................................................. 25
3.3. Изучение изменений химических составляющих пораженных тканей
растений .............................................................................................................. 28
4. СТЕРИЛИЗАЦИЯ ............................................................................................. 32
4.1. Стерилизация стеклянной посуды ............................................................ 32
4.2. Стерилизация питательных сред .............................................................. 33
4.3. Стерилизация почвы .................................................................................. 34
4.4. Стерилизация рабочего места ................................................................... 35
5. СРЕДЫ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ РАСТЕНИЙ ... 36
5.1. Основные жидкие среды (бульоны) для культивирования бактерий ... 37
5.2. Основная плотная питательная среда для культивирования бактерий 38
5.3. Селективные и дифференцирующие среды ............................................ 39
4
5.4. Подготовка скошенного агара .................................................................. 43
6. ВЫДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПАТОГЕНОВ РАСТЕНИЙ ................ 45
6.1. Выделение из образца больного растения ............................................... 45
6.2. Выделение из образца почвы .................................................................... 47
6.3. Выделение из образца полевой воды ....................................................... 48
6.4. Выделение из зараженного семенного материала .................................. 48
7. ОЧИСТКА ФИТОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КУЛЬТУР .......... 50
7.1. Получение одиночных бактериальных колоний ..................................... 50
7.2. Отбор одиночных колоний и субкультур бактерий ............................... 51
7.3. Проверка чистоты выделенной культуры ................................................ 51
8. ЭКСПРЕСС-ОЦЕНКА ПАТОГЕННОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИЗОЛЯТОВ
................................................................................................................................. 52
8.1. При гиперчувствительной реакции на табачное растение ..................... 52
8.2. При гиперчувствительной реакции на растение, не являющееся хозяином
............................................................................................................................. 53
8.3. По реакции бактерий на мягкие плоды .................................................... 53
9. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПАТОГЕННОСТИ ВЫДЕЛЕННОЙ БАКТЕРИАЛЬНОЙ
КУЛЬТУРЫ НА ЕСТЕСТВЕННЫХ РАСТЕНИЯХ-ХОЗЯЕВАХ ................... 55
9.1. Методом инфильтрации ............................................................................ 56
9.2. Методом инокуляции тампоном ............................................................... 56
9.3. Методом распыления инокуляции ........................................................... 56
9.4. Методом инокуляции погружением корней ............................................ 57
9.5. Методом вакуумной инфильтрации ......................................................... 57
9.6. Методом прививки булавочным уколом ................................................. 58
5
10. ВЫДЕЛЕНИЕ И ПОДСЧЕТ МИКРООРГАНИЗМОВ,
АССОЦИИРОВАННЫХ С БАКТЕРИАЛЬНЫМ ПАТОГЕНОМ РАСТЕНИЙ
ИЗ ПОЧВЫ, РИЗОСФЕРЫ И ФИЛЛОПЛАНА ................................................. 60
10.1. Выделение микроорганизмов из культивируемой почвы/почв под
системами возделывания сельскохозяйственных культур ........................... 60
10.2. Выделение ризосферной микрофлоры ................................................... 61
10.3. Выделение микроорганизма с поверхности корня ............................... 63
10.4. Выделение микроорганизмов из девственницы/необработанная/не
ризосферная почва ............................................................................................. 63
10.5. Выделение микрофлоры филлопланов методом последовательного
разведения .......................................................................................................... 64
10.6. Изучение микрофлоры филлопланов методом отпечатков листьев ... 66
11. ПОЛУЧЕНИЕ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР МИКРООРГАНИЗМОВ ................... 68
11.1. Методом полосовых пластин .................................................................. 69
11.2. Методом заливки пластин ....................................................................... 70
11.3. Методом разбрасывания пластин ........................................................... 72
12. ПОДДЕРЖАНИЕ И СОХРАНЕНИЕ ЧИСТЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ
КУЛЬТУР ............................................................................................................... 74
12.1. Сохранение на носителях ygca ................................................................ 75
12.2. Консервация в холодильнике или холодильной камере хранения ..... 75
12.3. Консервация в минеральном масле ........................................................ 75
12.4. Консервация при температуре -40°c в глицерине ................................. 76
12.5. Консервация в съедобных/несъедобных маслах ................................... 76
12.6. Консервирование методом жидкого азота (хранение при низких
температурах) ..................................................................................................... 77
12.7. Консервация парафиновым методом ..................................................... 77
12.8. Консервирование методом сублимационной сушки (лиофилизации) 78
6
13. ОКРАШИВАНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КУЛЬТУР ДЛЯ
МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ..................................................... 80
13.1. ПОДГОТОВКА БАКТЕРИАЛЬНЫХ МАЗКОВ ................................... 81
13.2. Простое или прямое окрашивание бактерий ......................................... 82
13.3. Отрицательное окрашивание бактерий .................................................. 83
13.4. Грамм окрашивания бактерий ................................................................ 85
13.5. Кислотно-быстрое окрашивание бактерий ............................................ 87
13.6. Окрашивание бактериальной клеточной стенки ................................... 88
13.7. Окрашивание цитоплазматических мембран ........................................ 89
13.8. Окрашивание бактериальных спор (эндоспор) ..................................... 90
13.9. Окрашивание капсул ................................................................................ 92
13.10. Окрашивание жгутиков ......................................................................... 95
13.12. Окрашивание жизнеспособности бактерий ......................................... 97
13.13. Реакция суслова для определения грамположительных и
грамотрицательные бактерии ........................................................................... 97
14. ПОДВИЖНОСТИ БАКТЕРИЙ ...................................................................... 99
14.1. Техника висячего падения для демонстрации подвижности бактерий99
14.2. Броуновское движение .......................................................................... 100
14.3. Связь вирулентности с подвижностью (у Erwinia carotovora var. Zeae)
........................................................................................................................... 100
15. ОПИСАНИЕ МОРФОЛОГИИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КОЛОНИЙ ............ 102
16. ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИЙ (ВЛИЯНИЕ
УСЛОВИЙ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ НА РОСТ БАКТЕРИЙ) .................... 103
16.1. Влияние температуры инкубации на рост бактерий .......................... 104
16.2. Определение термической точки гибели бактерий (TDP) ................. 105
16.3. Определение времени термической гибели бактерий ........................ 107
7
16.4. Влияние рН на рост бактерий ............................................................... 109
16.5. Влияние концентрации соли на рост бактерий ................................... 111
16.6. Влияние металлов на рост бактерий .................................................... 112
16.7. Влияние красителей на рост бактерий ................................................. 114
16.8. Влияние различных длин волн роста бактерий лайтона .................... 115
16.9. Смертельное воздействие ультрафиолетового излучения (уф-лучей) на
рост бактерий ................................................................................................... 117
16.10. Влияние относительной влажности воздуха на рост бактерий ....... 119
17. БИОХИМИЧЕСКИЕ ТЕСТЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ
ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ ..................................................................... 121
17.1. Испытание на получение амилазы (или демонстрация гидролиза
крахмала) .......................................................................................................... 122
17.2. Испытание на получение целлюлазы (деградация целлюлозы) ........ 123
17.2. Испытание на получение целлюлазы (деградация целлюлозы) ........ 125
17.3. Производство пектолитических ферментов (деградация пектина) .. 126
17.4. Гидролиз желатина, белка (производство желатиназы) ..................... 128
17.5. Гидролиз казеина .................................................................................... 130
17.6. Уреазный тест ......................................................................................... 131
17.7. Испытание на получение сероводорода............................................... 133
17.8. Катаболизм углеводов микроорганизмами (окисление и ферментация
глюкозы) ........................................................................................................... 134
17.9. Ферментация углеводов ......................................................................... 137
17.10. Микробная реакция в лакмусовом молоке ........................................ 138
17.11. Снижение содержания нитратов ......................................................... 141
17.12. Оксидазный тест ................................................................................... 141
17.13. Производство пигментов ..................................................................... 142
17.14. Испытания IMViC ................................................................................ 142
8
17.15. Каталазный тест .................................................................................... 147
18. ХАРАКТЕРИСТИКА ФИТОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ ВПЛОТЬ ДО
РОДА .................................................................................................................... 149
18.1. Agrobacterium .......................................................................................... 150
18.2. Pseudomonas ............................................................................................ 151
18.3. Ralstonia ................................................................................................... 152
18.4. Xanthomonas ............................................................................................ 153
18.5. Xylella ....................................................................................................... 153
18.6. Xylophilus ................................................................................................. 154
18.7. Pectobacterium ......................................................................................... 156
18.8. Pantoea ..................................................................................................... 156
18.9. Clavibacter (коринебактерии) ................................................................ 157
18.10. Curtobacterium ...................................................................................... 158
19. ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО РОДА В ГРУППУ ........... 160
20. ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ГРУППЫ НА ВИДЫ ......... 160
21. ИДЕНТИФИКАЦИЯ РАС БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПАТОГЕНОВ РАСТЕНИЙ
............................................................................................................................... 162
21.1. Идентификация рас X. campestris pv. campestris (Xcc) ...................... 162
21.2. Идентификация рас X. axonopodis pv. malvacearum ........................... 163
21.3. Идентификация рас X. axonopodis pv. viticola ..................................... 164
21.4. Идентификация рас X. oryzae pv. oryzae .............................................. 165
21.5. Идентификация рас Ralstonia solanacearum ........................................ 166
22. ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ, СВЯЗАННЫХ С
БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКОЙ ............................................... 169
22.1. ВЫДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ
(ПЕПТИДОГЛИКАН) ..................................................................................... 169
9
22.2. Выделение бактерий без клеточной стенки (L-форма) ...................... 175
22.3. Выделение бактериального экзополисахарида (EPS) ........................ 176
22.4. Выделение бактериального липида ...................................................... 178
22.5. Определение фактора секреции гликопротеинов ............................... 181
22.6. Тестирование EPS/GP для индукции реакции WS ............................. 181
23. ВЫДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ МЕТАБОЛИТОВ ............................. 183
23.1. Извлечение общего культурального фильтрата .................................. 183
23.2. Выделение бактериальных токсинов ................................................... 183
23.3. Выделение бактериальных ферментов ................................................ 185
23.4. Выделение бактериоцина ...................................................................... 196
23.5. Выделение сидерофора .......................................................................... 202
24. РОЛЬ БАКТЕРИАЛЬНОГО КОМПОНЕНТА В ИНДУКЦИИ РЕАКЦИИ
ЗАБОЛЕВАНИЯ ИЛИ ПАТОГЕНЕЗЕ .............................................................. 208
24.1. Эпс в индукции реакции заболевания .................................................. 208
24.2. Бактериальные ферменты в индукции реакции заболевания ............ 209
24.3. Бактериальные токсины в индукции реакции заболевания ............... 211
25. ПОДСЧЕТ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПОПУЛЯЦИИ ........................................ 213
25.1. Подсчет (подсчет) бактерий методом пластинчатого подсчета или
методом последовательного разведения агаровых пластин ....................... 213
25.2. Подсчет бактериальной популяции с помощью спектрофотометра . 215
26. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛЕДЯНОГО ЗАРОЖДЕНИЯ У ПАТОГЕННЫХ
БАКТЕРИЙ РАСТЕНИЙ .................................................................................... 219
26.1. Оценка ледяных нуклеационных свойств pseudomonas сиринги ...... 219
27. ПЕРЕДАЧА РАСТИТЕЛЬНЫХ ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ ЧЕРЕЗ
ПЕРЕНОСЧИКА .................................................................................................. 220
27.1. Передача бактерий (Xanthomonas) через личинок чешуекрылых
(пятнистых боллвормов) ................................................................................. 220
10
27.2. Передача бактерий (xanthomonas) через насекомое/жука (красный
хлопковый жук) ............................................................................................... 222
27.3. Передача Erwinia amylovora через пчел ............................................... 222
27.4. Передача эрвинии через пятнистых жуков .......................................... 224
27.5. Передача эрвинии нематодами ............................................................. 225
28. ОПРЕДЕЛЕНИЕ УВЕКОВЕЧИВАНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО ПАТОГЕНА
РАСТЕНИЙ .......................................................................................................... 227
28.1. В почве ..................................................................................................... 227
28.2. В посадочном материале ....................................................................... 228
28.3. В семенном материале ........................................................................... 229
28.4. В векторе ................................................................................................. 230
28.5. О реализации ........................................................................................... 231
29. ОПРЕДЕЛЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ .................................... 233
29.1. Определение вертикального сопротивления ....................................... 233
29.2. Определение горизонтального сопротивления ................................... 234
29.3. Определение горизонтального сопротивления с помощью одиночного
кольца ................................................................................................................ 235
30. ИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ С ПОМОЩЬЮ
ИММУНОДИАГНОСТИЧЕСКОГО МЕТОДА ............................................... 237
30.1. Получение бактериальных антигенов или антигенного гликопротеина
из бактериальных патогенов .......................................................................... 245
30.2. Иммунизация и получение антител ...................................................... 246
30.3. ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА МОНОКЛОНАЛЬНЫХ И
ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ (ОЦЕНКА СПЕЦИФИЧНОСТИ) ...... 253
30.4. Иммунодиагностические методы (реакция антиген–антитела) ........ 256
30.5. Использование специфического иммуноглобулина при
иммунофлуоресценции для выявления скрытой инфекции ....................... 276
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]