Nikolls_-_Ot_neyrona_k_mozgu

Раздел III. ИНТЕГРАТИВНЫЕ МЕХАНИЗМЫ

Глава 15. Клеточные механизмы интеграции и поведения у пиявок, муравьев и пчел

Эксперименты, выполненные на беспозвоночные внесли существенный вклад в понимание клеточных и молекулярных механизмов нейронной сигнализации. Благодаря простой нервной системе, беспозвоночные, такие как мухи, пчелы, муравьи, черви, улитки и ракообразные, являются удобными объектами для изучения того, каким образом в нервной системе происходит интеграция информации и формирование целенаправленного поведения..

Наглядным примером является ЦМС пиявки. У пиявки можно различить отдельные нейроны, изучить их биофизические свойства, проследить контакты нейронов и определить роль идентифицированных нейронов в интегративных поведенческих актах, таких как рефлексы плавания или уклонение от препятствий. ЦНС пиявки состоит из 21 стереотипного ганглия, в каждом из которых находится около 400 нейронов. Индивидуальные сенсорные нейроны, мотонейроны и интернейроны могут быть идентифицированы как визуально, так и электрофизиологически. Каждая механосенсорная клетка в ганглии, реагирующая на прикосновение, давление или болевую стимуляцию, иннервирует определенную зону поверхности тела. Сенсорные клетки передают информацию к вставочным и двигательным нейронам через химические и электрические синапсы. После повторной стимуляции с физиологической частотой передача в сенсорных нейронах блокируется в точках ветвления аксонов. Это связано с тем, что тонкие аксоны в местах ветвления образуют дочерние отростки, большие по размерам, чем материнская ветвь. Этот механизм способен обеспечить временную изоляцию чувствительных клеток. Изучая нейронные связи беспозвоночных, можно, кроме того, изучать, каким образом отдельные нейроны образуют синаптические контакты во время развития нервной системы или в процессе регенерации нейронов после повреждения.

Муравьи и пчелы способны к сложным поведенческим реакциям. Это представляет для исследователя заманчивую возможность, изучая поведение этих беспозвоночных, понять принципиальные механизмы интеграции информации в нервной системе. Так, можно проследить связь между поведением животного и физиологической активностью мозга, рассмотрев при этом, как себя ведут отдельные идентифицированные нейроны. Анализируя путь, пройденный муравьем или пчелой, можно попытаться понять всю систему от свойств фоторецепторов до нейронных сетей, которые в целом обеспечивают подобное поведение. Например, пустынные муравьи мигрируют на длинные дистанции в поисках пищи. Во время поиска муравей движется зигзагом, «маятникообразно», однако после того, как источник пищи найден, муравей разворачивается и следует по направлению к гнезду наикратчайшим путем. Его ЦНС учитывает все движения вправо и влево, выполненные муравьем во время поиска пищи, рассчитывает его текущее положение относительно исходной точки и находит кратчайший путь к ней.

Это возможно только при помощи точных координат, рассчитанных на основе поляризованного света солнца. Глаз пустынного муравья содержит особую группу фоторецепторов, способных воспринимать поляризованный свет. Эти фоторецепторы обеспечивают ЦНС информацией, необходимой для учета движений в пространстве и расчета нового вектора движения. Муравьи и пчелы являются примером того, как нервная система беспозвоночных при помощи относительно небольшого количества нейронов способна выполнять довольно сложные расчеты. Благодаря большому разнообразию нервных систем беспозвоночных, они являются излюбленным объектом для изучения клеточных механизмов поведения.

В этой книге мы не раз обращались к нейронам беспозвоночных для того, чтобы проиллюстрировать фундаментальные механизмы нейронной сигнализации. Так, например, при помощи большого по размерам аксона кальмара и его гигантского синапса были открыты универсальные законы проведения потенциала действия и принципы синаптической передачи. Клетки других беспозвоночных были использованы для того, чтобы проиллюстрировать пассивные электрические свойства мембран и механизмы ингибирования синаптической передачи.

Выбор беспозвоночных в качестве объектов исследований часто связан с методическими проблемами. Ряд технических проблем может быть проще разрешен с использованием нервной системы беспозвоночных. Во-первых, поскольку индивидуальные нервные клетки у них достаточно большие, то их можно использовать как для электрофизиологических, так и для молекулярно-биологических экспериментов. Во-вторых, хотя у беспозвоночных выработка определенного типа поведения требует определенных усилий, но оно всегда высокостереотипно, воспроизводимо и довольно легко может быть проанализировано. В- третьих, благодаря генетическим манипуляциям, плодовая мушка (Drosophifa melanogaster) и нематода Caenorhabditis elegans1) сыграли большую роль в изучении механизмов развития нервной системы. Эти механизмы остались настолько консервативными в процессе эволюции, что гены, кодирующие рецепторы или ионные каналы, имеют поразительно сходные последовательности у мух, червей и высших позвоночных (главы 13 и 23). Например, у человека, так же как у дрозофилы или пиявки, гомеобоксные гены ответственны за развитие

сегментов туловища, основных отделов мозга и специализированных органов, таких как глаза2· 3).

В то же самое время надо подчеркнуть, что любопытство исследователей при изучении нервной системы беспозвоночных не ограничивается только изучением тех принципов, которые в дальнейшем можно использовать для понимания организации нервной системы высших животных или человека. То, каким образом пиявка осуществляет плавательные движения, муравей ориентируется в пространстве, пчела «танцует», сверчок «поет» или мухи летают, все это является само по себе удивительно интересной проблемой.

§ 1. От нейрона к поведению и обратно

Беспозвоночные предоставляют возможность проследить путь развития нейрона от рождения отдельной клетки до образования отростков и формирования связей. На подходящем беспозвоночном с большими нейронами можно проанализировать биофизические свойства отдельных клеток и наблюдать, как формируется координированное поведение всего организма. Аналогично можно изучать реакции на молекулярном уровне в клетках при изменении поведения животного в ответ на внешние влияния и заложенные внутренние программы. Подобного рода анализ возможен благодаря тому, что поведенческие реакции беспозвоночных высокостереотипны и осуществляются при участии относительного небольшого числа нейронов, в то время как подобные реакции у млекопитающих требуют участия тысяч нейронов.

Каждый вид нервной системы беспозвоночных имеет определенные преимущества для изучений той или иной проблемы. Нейронные сети, ответственные за элементы координированного поведения, такие как позные рефлексы, кормление, суточные ритмы, реакции избегания и плавание, были изучены на речных раках и улитках4· 5). ЦНС насекомых была использована для изучения различных проблем, включая развитие и регенерацию НС, полет и перемещение по земле, ориентацию в пространстве и коммуни-

кация при помоши звуков6)--9). Количество видов беспозвоночных и спектр решаемых проблем настолько велики, что практически невозможно сделать общий обзор данной темы. К примеру, написано большое количество монографий о моллюске Aplysia, пиявках, морской улитке Hermissenda, речных раках и изолированных культурах нервных клеток беспозвоночных10)--14).

Для дальнейшего обсуждения мы выбрали нервные системы трех беспозвоночных. Пиявка, с ее примитивным поведением, стереотипным строением и функциями ЦНС и небольшим количеством нервных клеток, позволяет детально изучить свойства, связи и функции отдельных нервных клеток. У пчел же и муравьев изучение начинается с их коллективного поведения, что позволило подробно исследовать механизмы, позволяющие данным насекомым ориентироваться в пространстве, используя поляризованный свет и магнитные поля.

§ 2. Интеграция информации отдельными нейронами в ЦНС пиявки

Со времен Древней Греции и Рима пиявки использовались врачами для лечения больных, страдающих такими заболеваниями, как эпилепсия, стенокардия, туберкулез, менингит и геморрой — довольно неприятное лечение, которое почти всегда приносило больше вреда, нежели пользы несчастным жертвам. К XIX веку использование медицинских пиявок приняло такой масштаб, что они практически исчезли в Западной Европе. Поэтому Наполеон был вынужден импортировать около 6 миллионов пиявок в год из Венгрии для лечения своих солдат. Эта «мания» хирудотерапии принесла свои определенные плоды: использование пиявок в медицине способствовало изучению их размножения, развития и анатомии. В конце XIX века основатели экспериментальной эмбриологии, такие как, например, Уитман, выбрали именно пиявку для того, чтобы проследить судьбу ранних эмбриональных клеток. Аналогичным образом их НС была тщательно изучена плеядой выдающихся анатомов, включая Рамон--и-Кахаля, Санчеса. Гаскелла, Дель Рио Хортега, Одури и Ретциуса15). Затем интерес к пиявкам упал и вновь появился в I960 году, когда Стивен Куффлер и Давид Поттер16) впервые применили современные нейрофизиологические методики для изучения свойств ее НС. Это способствовало началу интенсивного изучения ее развития17, 18), биофизики и молекулярной биологии 19)--22), нервных связей и поведения23)--25).

Нервные клетки муравьев и пчел меньше по размеру и более трудны для изучения. Тем не менее, используя высокоточные наблюдения и эксперименты, можно раскрыть клеточные и интегративные механизмы, лежащие в основе их поведения. Именно таким образом стало возможно анализировать механизмы восприятия информации, используемые при решении задач высокой сложности муравьями и пчелами. Такой задачей является обнаружение удаленной цели и затем поиск кратчайшего пути обратно к гнезду. Системный подход к клеточной нейробиологии возможен только при подобного рода анализе: от поведения к мозгу, от целого мозга к отдельному нейрону. В следующих главах, которые посвящены сенсорным механизмам, восприятию и двигательной координации в ЦНС млекопитающих, мы вновь увидим, что отправной точкой в исследованиях клеточных механизмов является именно поведение (например, локация источника звука в пространстве).

Ганглии пиявки: полуавтономные единицы

Тело и НС пиявки сегментировано и состоит из большого числа стереотипных повторяющихся единиц (сегментов), которые имеют сходное строение. Каждый сегмент иннервируется стереотипно устроенным ганглием, все ганглии имеют близкое строение. Даже специализированный головной и хвостовой «мозг», изображенный на рис. 15.1, состоит из слившихся ганглиев, и в нем легко прослеживаются многие свойства, характерные для сегментарного ганглия26).

Каждый ганглий состоит примерно из 400 нейронов, которые имеют определенную форму, размер, расположение и ветвление (branching pattern). Ганглий иннервируетопределенную зону тела посредством парных нервов, а также соединяется с соседними и удаленными частями НС посредством дополнительных пучков волокон (коннектив). Интеграция информации осуществляется последовательно на следующих хорошо различимых этапах:

представлена цепочкой из

кольцо содержит нервные окончания сенсорных

прикосновению (сенсиллы). (В) Нервная

продольный. Кроме того, имеются дорзовентральные мышцы, сокращение которых уплощает пиявку, а также мышечные волокна непосредственно под кожей, образующие при сокращении складки.

Fig. 15.1. Central Nervous System of the Leech. (A) The CMS of the leech consists of a chain of 21 segmentai ganglia, a head ganglion, and a tail ganglion. Over most of the body, five circumferential annuli make up each segment; the central annulus is marked by sensory end organs responding to light and touch (the sensillae). (B) The nerve cord lies in the ventral part of the body within a blood sinus. Ganglia, which are linked to each other by bundles of axons (the connectives), innervate the body wall by paired roots. The muscles are arranged in three principal layers: circular, oblique, and longitudinal. In additioa there are dorsoventral muscles that flatten the animal, and fibers immediately under the skin that raise it into ridges.

1.Каждый сегментарный ганглий получает информацию от кольцевидного участка тела, который им регулируется.

2.Соседние ганглии влияют друг на друга посредством прямых связей.

3.Координированная работа всей нервной трубки и всего червя регулируется терминальными ганглиями, расположенными на обоих концах тела.

Наверное, самое привлекательное в изучении пиявок — это то, как нервный ганглий выглядит под микроскопом, когда отдельные нейроны хорошо различимы и имеют удивительно сходное строение от сегмента к сегменту, от особи к особи, от вида к виду (рис. 15.2). Глядя на это скопление клеток, расположенных в строгом порядке, нельзя не удивиться: каким образом они, эти отдельные клетки, образуют «мозг» и способны регулировать движение животного, остановки, уклонение от препятствий, спаривание, кормление и чувствительность? Кроме эстетического удовольствия от препарата, можно получить и интеллектуальное, раскрывая структуру связей и логику хорошо организованной НС на основе свойств отдельных клеток.

Прежде чем узнать, каким образом пиявка осуществляет свои движения, необходимо изучить отдельные клетки: их свойства, соединение и функции.

Рис. 15.2. Сегментарный ганглий пиявки (вид с вентральной стороны). Отдельные клетки четко различимы. Буквами отмечены: три клетки, отвечающие на прикосновение (Т), пара клеток, реагирующих на давление (Р) и болевую

(N) механическую стимуляцию. Каждый тип сенсорных клеток отвечает на раздражение собственными потенциалами действия, показанными ниже. Импульсы Т клеток короче и меньше, чем в Ρ и N клетках. Над сигналами показан уровень тока, пропускаемого через клетки при помощи микроэлектродов. Клетки, расположенные на задней поверхности ганглия, обведенные в кружок, являются АЕ мотонейронами. S нейрон представлен небольшим непарным нейроном, связанным со своими гомологами в соседних ганглиях. Этот нейрон принимает участие в рефлексах избегания у пиявки.

Сенсорные клетки в ганглиях пиявки

Когда кто-то задевает, давит или прищипывает кожу пиявки, она отвечает серией движений. Один или несколько сегментов резко сокращаются, на поверхности появляется серия четко различимых складок. Затем пиявка изгибается, разворачивается и уплывает прочь.

Отдельные сенсорные и моторные клетки можно отличить друг от друга по форме, размеру, расположению и электрическим характеристикам27)--29). На рис. 15.2 показано распределение отдельных сенсорных клеток, мотонейронов и интернейронов в ганглиях пиявок. 14 нейронов, помеченных Т, Ρ и N на рис. 15.2, являются чувствительными по 3-м основным сенсорным модальностям. Каждая из клеток избирательно отвечает на прикосновение (Т), давление (Р) или ноцицептивную (Ν) — механическую стимуляцию кожи. Рис. 15.3 иллюстрирует ответы чувствительных клеток на различные кожные раздражители. Т клетки на легкое прикосновение к поверхности кожи отвечают бы-

Рис. 15.3. Сигналы сенсорных клеток пиявки в ответ на кожную стимуляцию.

Внутриклеточная регистрация активности Т, Ρ и N клеток (см. рис. 15.2). Препарат представлен кусочком кожи и иннер вирующим ее ганглием. При прикосновении к рецептивному полю происходит активация клеток. (А) Т клетка отвечает на легкое прикосновение, недостаточное по силе, чтобы активировать Ρ клетку. (В) Более сильное постоянное давление вызывает продолжительный разряд Ρ клетки и быстро адаптирующийся on/off ответ Т клетки. (С и D) Для активации N клетки требуется еще более сильное давление.

Intracellular records of Т. Р, and N sensory cells (see Figure 15.2). The preparation consists of a piece of skin

pressing their receptive fields in the skin. (A) A T cell responds to light touching that is not strong enough to

prolonged discharge from the

response from the Τ cell. (C and D) Still stronger pressure is needed to activate the N cell. (After Nicholls and

Baylor, 1968.)

стрыми короткими сигналами (рис. 15.3А). Их чувствительные окончания состоят из небольших утолщений, расположенных между эпителиальными клетками на поверхности кожи. Т клетки быстро адаптируются к производимому давлению и прекращают активность уже через доли секунды. Ρ клетки отвечают только на определенное давление на кожу и дают медленно затухающий ответ (рис. 15.3В). N клеткам нужны еще более сильные механические раздражители: такие, как радикальная деформация кожи, например, при прищипывании кожи тупым пинцетом (рис. 15.3D). Модальности и ответы этих нейронов у пи-

явки аналогичны реакции механорецепторов кожи человека (глава 18), которые способны различать прикосновение, давление и болевые раздражители. У беспозвоночных, однако, одиночная нервная клетка способна выполнять функцию многих чувствительных клеток кожи человека, иннервирующих, к примеру, кончики пальцев — очень густо иннервированную зону.

На рис. 15.4 показано, что каждая чувствительная клетка иннервирует строго определенную территорию. Эта территория может быть очерчена посредством регистрации активности клетки при раздражении кожи механическими стимулами или окрашиванием клетки и ее аксонов специальными маркерами, например, пероксидазой хрена (horseradish peroxidase)30). Границы иннервируемой

зоны могут быть четко идентифицированы также по различным ориентирам, таким как сегментация или окраска тела, так что можно с уверенностью сказать, какая именно клетка активируется при прикосновении, давлении или пришипывании определенной области кожи. Таким образом, одна Т клетка, чувствительная к прикосновению, иннервирует кожу дорзальной и вентральной части, а также треть боковой поверхности сегмента. Аналогично, две чувствительные Р-клетки разделяют поверхность сегмента на 2 примерно одинаковые области: вентральную и дорзальную. Пример развитой и стереотипной системы ветвления Р- клетки, полученный при использовании пероксидазы хрена (horseradish peroxidase), изображен на рис. 15.4. Т и N клетки также посылают отростки к соседним ганглиям, которые потом иннервируют вторичные зоны по обе стороны от исходного сегмента31). Конечные веточки отдельных чувствительных клеток иннервируют кольцевидный участок тела. Области их иннервации не перекрываются, хотя окончания разных нейронов одной модальности могут иногда вторгаться на чужую территорию. Как будет показано далее, в этом случае проведение в мельчайших веточках таких нейронов блокируется. Когда границы иннервируемых областей так хорошо различимы, также можно определить, каким образом происходит формирование зон иннервации при развитии и регенерации32· 33).

Добавочные сенсорные клетки, специфически реагирующие на свет, химические

раздражители, вибрацию и растяжение, были обнаружены в головном конце, а также в теле пиявки34· 35).

Моторные клетки

Индивидуальные моторные клетки ганглия пиявки показаны на рис. 15.2. Критерием того, что данные клетки являются моторными, служит тот факт, что каждый импульс данной клетки вызывает потенциал действия в ее аксоне, идущем к мышце, а затем и синаптический потенциал мышечного волокна. Более 20 пар двигательных клеток, иннервирующих мускулатуру, а также управляющих работой «сердца», были обнаружены в сегментарном ганглии28). Благодаря им пиявка способна уплощаться, вытягиваться, сокращаться и изгибаться. Мышцы получают тормозное и модулирующее пептидэргическое влияние, а также возбуждающие импульсы через ацетилхолиновые синапсы. Нехватка всего одной клетки вызывает очевидный дефект в поведении — подобно генетическим "knockout" экспериментам на одиночных зрелых нейронах36). Например, в каждом ганглии имеется только по одной двигательной клетке справа и слева, которые управляют сегментарной мышцей эректора тела (annulus erector, помечена как АЕ на рис. 15.2). Импульсация этих клеток приводит к образованию на коже пиявки поперечных складок, подобных мехам баяна (рис. 15.5). Можно убить эту двигательную клетку путем введения смеси протеолитических ферментов (проназ) в сегмент интактного животного. После этого пиявка не способна выпрямлять сегмент тела, иннервируемый ранее данным двигательным нейроном, в ответ на соответствующую сенсорную стимуляцию. Однако подобный дефект непостоянен, постепенно веточки из соседних, интактных нейронов возмещают дефект иннервации37).

Взаимодействие чувствительных и двигательных нейронов

В нервной системе беспозвоночных синапсы между нейронами обычно располагаются не на соме, а на отростках в центральной части ганглия (область нейропиля)26, 38)--40). Синаптические потенциалы из нейропиля распространяются на сому клетки, где они и регистрируются как тормозные или возбуждающие потенциалы. Токи, протекаюшие через сому клетки, способны влиять на синаптические потенциалы и высвобождение медиатора. Несмотря на сложность строения, организация нейропиля крайне упорядочена. Это было установлено в экспериментах Мюллера и МакМахана, которые первыми разработали методику внутриклеточного введения пероксидазы хрена на изолированных нейронах пиявки.

Характер ветвления чувствительных и двигательных клеток в нейропиле имеет свои особенности: каждая клетка демонстрирует свойственную только ей конфигурацию. Примеры типичного ветвления отдельных нейронов изображены на рис. 15.4 и 15.5. Единичная чувствительная клетка образует много модулирующих синапсов с другими клетками, получая в то же время регуляторные импульсы от значительного количества нервных клеток. Электрические синапсы напоминают щелевые контакты (gap junctions) с зазором поряд-

Рис. 15.5. Структуры пресинаптичес ких и постсинаптических клеток, выявленные путем внутриклеточной инъекции пероксидазы хрена. (А) Ветвистая древовидная структура Ρ клеток (см. рис. 15.4) с большим количеством маленьких утолщений, которые являются активными зонами пресинапти ческих окончаний, секретирующими медиатор. (В) L мотонейрон посылает свой аксон в составе контралатеральных корешков. Его отростки в ганглии не имеют расширений, ибо являются постсинаптическими зонами, образующими синапсы. (С) Синапс (показано стрелкой) между Ρ клеткой и L мотонейроном в области нейропиля. Пероксидаза хрена была введена в обе клетки.

Fig. 15.5. Structures of Preand Postsynaptic Cells labeled by intracellular injection of horseradish peroxidase. (A) The arborization of a P cell (shown in Figure 15.4) is profuse with numerous small varicosities. They represent sites of presynaptic endings that release transmitter. (B) The L motoneuron sends its axons out through con tralateral roots. Its processes within the ganglion are smooth and represent postsynaptic sites upon which synapses are made. (C) A synapse (arrow) made by a P cell on an L motoneuron in the neuropiL Both cells were injected with horseradish peroxidase. (After Muller,

1981.)

ка 4-6 нм между мембранами. Флуоресцентные красители, такие как люцифер желтый при введении их в клетку обычно, но не всегда, проходят через электрические синапсы и проникают в соседние клетки.

Т, Ρ и N клетки, отвечающие на соответствующие механические стимулы, образуют возбуждающие связи с L клетками (названными так потому, что они иннервируют продольные — longitudinal — мышцы), которые управляют сокращением пиявки. Несколькими способами, в том числе и посредством электронной микроскопии, было показано, что эти связи являются прямыми, т. е. отсутствуют какие-либо вставочные нейроны41). Это является очень важным фактом, так как только при условии, что известны все составляющие данной цепочки, состоящей из нервных клеток, можно точно выделить те участки, на которых происходят интересные изменения сигнала.

Механизм передачи сигнала на двигательные L клетки различен и уникален для каждой чувствительной клетки. N клетки образуют химический синапс (с еле заметным намеком на электрическое соединение), Т клетки формируют выпрямляющий электрический синапс, а Р клетки — комбинацию обоих способов41). Также Ρ и N клетки образуют прямые химические синапсы еще на одной клетке — АЕ мотонейроне. Трансмиттерами служат ацетилхолин, ГАМК, глутамат, дофамин, серотонин и пептиды42)--44).

Кратковременные изменения синаптической передачи

Во время того, как пиявка плывет или передвигается по поверхности, механическая стимуляция кожи вызывает серии импульсов. В этих условиях повторной активности пе-

редача в химических синапсах значительным образом меняется по силе (глава 12). Различная активность разных химических синапсов способствует последовательной активации или инактивации двух различных постсинаптических мишеней одним чувствительным нейроном45), активируя сначала одну, а потом другую. Такой тип «дифференцированно-