Методичні рекомендації для самостійної роботи

студентів медичного факультету

при підготовці до практичного заняття № 15

1.Тема заняття: Реакції з використанням мічених антигенів і антитіл.

2. Мета заняття:

2а. Загальна: Засвоїти принципи, механізми та призначення імунофлюоресцентного, радіоімунного та імуноферментного методів в діагностиці.

2б. Конкретна:

1. Оволодіти технікою постановки імунофлюоресцентного, радіоімунного та імуноферментного методу.

2. Вміти інтерпретувати результати прямого та непрямого імунофлюоресцентного методу, а також імуноферментного аналізу (ІФА).

3. Базові знання, навички, необхідні для вивчення теми.

3.1. Корпускулярні та розчинні антигени.

3.2. Принципи серологічної діагностики інфекційних захворювань.

3.3. Серологічна ідентифікація збудників, як один з основних методів дослідження мікроорганізмів.

4. Основні теоретичні питання, що підлягають вивченню.

1. Імунофлюоресцентний метод, феномени, які лежать в його основі.

2. Методичні варіанти реакції імунофлюоресценції (РІФ): прямий та непрямий методи Кунса.

3. Техніка постановки і діагностичне використання РІФ.

4. Радіоімунологічний аналіз (РІА), його принцип і призначення.

5. Імуноферментний аналіз (ІФА). Твердофазний імуноферментний метод. Його принцип та механізм взаємодії інгредієнтів.

6. Імуноблотінг. Етапи дослідження.

7. Використання ІФА та імуноблотінга в діагностиці інфекційних захворювань.

5. Зміст теми

Реакції, в яких приймають участь мічені антигени або антитіла (імунофлюоресценції, радіоімунний та імуноферментний методи) по своїй чутливості перевершує всі серологічні реакції.

Реакція імунофлюоресценції Кунса (РІФ) дозволяє виявити мікробні антигени в патологічному матеріалі з допомогою мічених флюорохромами діагностичних сироваток. При наявності специфічних антигенів для діагностичної сироватки в люмінісцентному мікроскопі виявляють світінення (прямий метод).

В непрямому методі спочатку антиген зв’язують з звичайним антигеном, а потім цей комплекс обробляють міченим антиглобуліном, який з’єднується з ним. Утворюється комплекс легко виявляють по світінню в люмінісцентному мікроскопі.

В радіоімунному методі (РІМ) використовують очищенні і концентровані антигени та антитіла, мічені радіоізотопом. РІМ використовують для виявлення як антигенів, так і антитіл. Для виявлення антитіл до досліджуваної сироватки додають певну кількість міченого антигену. Для виявлення антигену до досліджує мого матеріалу додають специфічну діагностичну сироватку, а потім – гомологічний мічений антиген. Якщо мічений антиген залишається вільним – реакція позитивна.

Імуноферментний метод (ІФМ.) використовується для виявлення антигенів і антитіл з застосуванням твердофазних носіїв (полістеролові або полівінілові пластини). Для виявлення антитіл використовують пластини, на дні яких знаходяться фіксовані антигени і додають досліджувану сироватку. Потім (після промивки буфером) обробляють антисироваткою (антиглобуліном), міченою ферментом, для виявлення якого використовують Н₂О₂ та індикатор.

Для виявлення антигену використовують пластини з діагностичною сироваткою, а потім (після промивки буфером) обробляють антисироваткою міченої ферментом, виявлення якого проводять з використанням Н₂О₂ та індикатора.

ІФМ знаходить широке використання в діагностиці вірусних інфекційних захворювань.

Граф логічної структури реакції імунофлюоресценції (РІФ).

Досліджуваний матеріал: патологічний матеріал, який містить бактеріальні або вірусні антигени.

Постановка прямої РІФ (метод Кунса) з діагностичними специфічними флюоресцуючими сироватками.

Постановка непрямої РІФ супроводжується використанням флюоресцуючої антиглобулінової сироватки, яка містить антитіла тільки проти кролячих глобулінів.

Граф логічної структури імуноферментного методу (ІФМ).

Постановка ІФМ з метою виявлення антигенів або антитіл з використанням пластикових (полістиролових) панелей з адсорбованими на дні лунок антитіл або антигенів.

Використання ІФМ для виявлення антигенів та антитіл:

Визначення антитіл

Антиген (АГ) + Антитіла (АТ) (сироватка хворого)

		+ Антиглобулінова сироватка з ферментом (АГСФ)
	АГ + АТ

		+ Н2О2 + ортофенілдіамін (ОФД)
	АГ + АТ + АГСФ

Відповідь

Визначення антигенів

Антитіла (АТ) + Антиген (АГ) (досліджуваний матеріал)

		+ Антиглобулінова сироватка з ферментом (АГСФ)
	АТ + АГ

		+ Н2О2 + ортофенілдіамін (ОФД)
	АТ + АГ + АГСФ

відповідь

Використання імунофлюоресцентного методу в діагностиці інфекційних захворювань:

Прямий метод (метод Кунса)

Антиген (АГ)	+	Антитіла (АТ) (специфічні флюоресцуючі)			Комплекс, що світиться
				АГ + АТ

Непрямий метод

Антигени (АГ) + Антитіла (АТ)

		+ Антиглобулінова сироватка (АГС)
	АГ + АТ

		+ Комплекс, що світиться
	АГ + АТ + АГС