Методичні рекомендації для самостійної роботи

студентів медичного факультету

при підготовці до практичного заняття №17

1. Тема: Практичні навички змістових модулів 2, 5, 9. Метод Грама. Визначення чутливості у бактерій до ХТЗ. Облік серологічних реакцій.

2.Мета заняття.

2а. Загальна: Вміти проводити мікроскопічну та серологічну діагностику інфекційних хвороб. Проводити раціональний вибір антимікробних хіміотерапевтичних засобів для лікування захворювань мікробної етіології.

2б. Конкретна:

1. Вміти приготувати мазок із суміші грампозитивних та грамнегативних бактерій, пофарбувати за Грамом, визначити їх морфологічні та тінкторіальні властивості.

2. Вміти провести облік результатів основних серологічних реакцій, що використовують в серологічній діагностиці інфекційних хвороб.

3. Вміти провести дослідження чутливості мікроорганізмів до хіміотерапевтичних засобів. Оцінити результати. Дати рекомендації щодо вибору хіміотерапевтичного засобу для лікування інфекційної хвороби, викликаної збудником, чутливість якого вивчали.

3.Базові знання, навички, необхідні для вивчення теми.

3.1.Методи вивчення морфології бактерій.

3.2.Метод Грама, мета застосування, методика фарбування за Грамом.

3.3.Призначення серологічних реакцій, види, методика постановки розгорнутої РА, РНГА, РЗК, ІФА.

3.4.Серологічний метод діагностики інфекційних хвороб. Поняття про діагностичний титр.

3.5.Методика вивчення чутливості бактерій до антибіотиків диско-дифузійним методом, оцінка результату, запис антибіотикограми.

3.6.Метод серійних розведень, призначення, методика постановки, врахування результатів, визначення мінімальної бактеріостатичної та бактерицидної концентрацій.

4. Основні теоретичні питання, що підлягають вивченню.

1. Мікроскопічний метод дослідження: методика виготовлення препарату, фіксації та забарвлення за методом Грама.

2. Серологічний метод дослідження. Серодіагностика інфекційних захворювань. Визначення титру сироватки пацієнта.

3. Розгорнута реакція аглютинації, методика постановки, врахування результату.

4. Реакція непрямої гемаглютинації, методика постановки, врахування результату.

5. Реакція зв’язування комплементу, методика постановки, врахування результату.

6. Імуноферментний аналіз, методика постановки, врахування результату.

7. Диско-дифузійний метод визначення чутливості бактерій до антибіотиків, методика постановки, врахування результату.

8. Визначення чутливості бактерій до антимікробних препаратів методом серійних розведень, методика, врахування МБсК, МБцК.

5.Зміст теми.

Метод Грама є базовим методом вивчення морфології бактерій, який дозволяє визначити тинкторіальні властивості бактерій. В залежності від будови клітинної стінки бактерії зафарбовуються у синьо-фіолетовий (грам-позитивні) або рожевий (грам-негативні) колір. При фарбуванні за Грамом використовують наступні барвники: генціанвіолет, розчин Люголя (закріплювач), етиловий спирт (знебарвлюючий реагент), розчин фуксину. Методика фарбування описана в занятті №3.

Реакція аглютинації (РА) широко використовується в лабораторній діагностиці інфекційних захворювань. Її використовують як для ідентифікації збудника з допомогою діагностичних аглютинуючих сироваток, так і для визначення антитіл в сироватці крові хворого по відомим антигенам (діагностикумам).Для виявлення антитіл в сироватці хворого до її розведень (1:50-1:1600) додають відомий діагностикум і вміщують в термостат (37^оС) на 18-24 години. Потім визначають титр антитіл по появі зерен або пластівців аглютинату в розведеннях сироватки, в контролі діагностикуму – рівномірне помутніння, в контролі сироватки – рідина прозора.

Реакція пасивної гемаглютинації (РПГА) широко використовується для виявлення специфічних антитіл в сироватці крові хворого при вірусних та інших інфекційних захворюваннях. Для цього використовують стандартний еритроцитарний діагностикум, що містить антигени збудника, адсорбовані на еритроцитах барана, який додають до розведень сироватки хворого в лунки планшету. Інкубують в термостаті (37^оС) проводять первинний облік через 2 години, кінцевий – через 18-20 годин. Позитивна РПГА виражається в появі на дні лунок крихкого осаду у вигляді парасольки, негативна – осад в вигляді компактного диску з рівними краями.

Реакція зв’язування комплементу (РЗК) складається з 2 систем: антиген + антитіло + комплемент (І система), завись еритроцитів + гемолітична сироватка (ІІ система). Проходить в 2 фази: І специфічна, яка обумовлює зв’язування комплементу в разі відповідно до антитіл та антигену, при невідповідності –антиген залишається вільним. При введені в дослід ІІ індикаторної системи гемоліз відбудеться тільки при наявності вільного комплементу (реакція негативна). В разі, коли комплемент адсорбувався на системі антиген-антитіло, гемоліз не відбувається (реакція позитивна). Здійснюється постановка РЗК з метою виявлення антитіл в сироватці хворого з допомогою відтитрованих антигена та комплементу в робочих дозах. Дослід супроводжується 2 контролями: сироватки (фізрозчин, сироватка, комплемент) та антигену (фізрозчин, антиген, комплемент). Одночасно готується індикаторна система. Обидві системи витримуються в термостаті 40 хв., після чого до основного досліду та контролів додається гемсистема. Повторно витримується реакція в термостаті до появи гемолізу в контролях. РЗК вважається позитивною при затримці гемолізу в дослідній пробірці.

Імуноферментний метод (ІФМ.) використовується для виявлення антигенів і антитіл з застосуванням твердофазних носіїв (полістеролові або полівінілові пластини). Для виявлення антитіл використовують пластини, на дні яких знаходяться фіксовані антигени і додають досліджувану сироватку. Потім (після промивки буфером) обробляють антисироваткою (антиглобуліном), міченою ферментом, для виявлення якого використовують Н₂О₂ та індикатор.

ІФМ знаходить широке використання в діагностиці вірусних інфекційних захворювань.

З метою визначення чутливості бактерій до антибіотиків використовують стандартні паперові диски, які містять певну кількість аньтибіотика. Добову культуру дослідного штаму бактерій висівають на пластінковий агар суцільним газоном (методика посіву за Дригальським) і поміщають на засіяну поверхню МПА диски з антибіотиками (5-8 на одну чашку); посіви приміщують в термостат на 20-24 год, а потім враховують результат шляхом вимірювання зон затримки росту навколо диску. При діаметрі зони більше 15 мм культура враховується як чутлива, більше 20 мм – високочутлива; при діаметрі менше 10 мм – нечутлива до даного антибіотика.

Метод серійних розведень використовують для визначення мінімальних бактеріостатичних та бактерицидних концентрацій антимікробних препаратів щодо тестової культури. Для цього дослідну культуру мікроорганізму висівають у пробірки з різними концентраціями хіміопрепарату, інкубують в термостаті і враховують бактеріостатичну концентрацію препарату на підставі відсутності ознак росту в пробірці з певною концентрацією. Для визначення бактерицидної концентрації вміст пробірок висівають на чашку з МПА, інкубують в термостаті, враховують результат на підставі відсутності ознак росту в певному секторі.