Методичні рекомендації для самостійної роботи студентів медичного факультету при підготовці до практичного заняття №6

1. Тема: Фізіологія мікроорганізмів. Живлення та розмноження бактерій. Ферментативна активність бактерій. Виділення чистих культур аеробів. Бактеріологічний метод діагностики інфекційних захворювань

2. Мета заняття:

2а. Загальна: Вміти обрати необхідне для посіву поживне середовище, вміти проводити посіви бактерій на різні поживні середовища, вміти ідентифікувати виділену чисту культуру бактерій за допомогою визначення її біохімічної активності.

2Б. Конкретна:

1. Вивчити поживні середовища і їх склад.

2. Засвоїти техніку посіву мікроорганізмів з метою отримання ізольованих колоній.

3. Ознайомитись з термостатом, який використовується для культивування бактерій.

4. Засвоїти методи виділення чистих культур аеробів.

5. Вміти провести ідентифікацію мікроорганізмів за культуральним властивостями.

6. Ознайомитись з сахаролітичними, амілолітичними та гемолітичними властивостями мікроорганізмів в демонстраційних дослідах.

7. Засвоїти методи експрес – ідентифікації бактерій за біохімічними властивостями.

3. Базові знання, навички, необхідні для вивчення теми.

   1. Енергетичний обмін у бактерій.

   2. Біологічне окислення у бактерій.

   3. Ферменти бактерій.

4. Основні теоретичні питання, що підлягають вивченню.

4.1. Метаболізм бактерій, як спосіб отримання поживного матеріалу та енергії.

4.2. Механізм живлення бактерій. Класифікація бактерій за типом живлення та характером використання енергії.

4.3. Принципи культивування бактерій.

4.4. Поживні середовища, класифікація. Вимоги до поживних середовищ.

4.5. Механізм розмноження бактерій.

4.6. Фактори росту та розмноження бактерій.

4.7. Швидкість та фази розмноження бактерій. Поняття “колонія”, “культура” .

4.8. Етапи виділення чистих культур бактерій.

4.9. Культуральні властивості бактерій методи вивчення.

4.10. Біохімічна активність бактерій.

4.11. Класифікація ферментів бактерій.

4.12. Поживні середовища, що використовуються для біохімічної ідентифікації бактерій.

4.13. Методи вивчення біохімічних властивостей бактерій.

4.14. Значення вивчення біохімічної активності бактерій для ідентифікації.

4.15. Використання ферментів бактерій в медичній практиці і промисловості.

3. Зміст теми:

Граф логічної структури змісту:

Фізіологія мікроорганізмів вивчає біохімічні процеси, що відбуваються в клітині і забезпечують її енергетичні потреби та відтворення структурного матеріалу, що йдуть на ріст і розмноження. Бактеріям притаманний голофітний тип живлення – вони утилізують поживні речовини із водних розчинів всією поверхнею клітини.

За механізмом проникненням поживних речовин в бактеріальну клітину розрізняють:

- енергонезалежні: проста дифузія, полегшена дифузія;

- енергозалежні: активний транспорт, транспорт, обумовлений фосфорилюванням.

Класифікація бактерій за типом живлення:

1. Залежно від джерела вуглецю та азоту

- аутотрофи (аміноаутотрофи) джерелом є неорганічні сполуки вуглецю і азоту;

- гетеротрофи (аміногетеротрофи) джерелом є органічні сполуки вуглецю та азоту;

За джерелом отримання енергії:

• фотосинтез – джерелом енергії є сонячне світло (фототрофи)

• хемосинтез – джерелом енергії є окисно-відновні реакції розщеплення хімічних сполук (хемотрофи)

Основний метод мікробіологічної діагностики інфекційних хвороб, який дозволяє встановити етіологічний чинник є бактеріологічний метод. Метод передбачає виділення чистої культури збудника з інфекційного матеріалу та його ідентифікацію за критеріями, прийнятими класифікацією.

Для культивування мікроорганізмів, насамперед, потрібні поживні середовища. Вони готуються безпосередньо в лабораторіях з натуральних продуктів або з напівфабрикатів, що випускаються мікробіологічною промисловістю. Вирощування мікроорганізмів на поживних середовищах або культивування є універсальним підходом при їх вивченні. Особливість у вимогах до складу поживних середовищ та у характері росту на них є важливою характеристикою для визначення виду мікроорганізму.

Існує наступна класифікація поживних середовищ:

1. за походженням - природні, синтетичні, напівсинтетичні;

2. за консистенцією - рідкі, напіврідкі, щільні;

3. за призначенням – універсальні, спеціальні (селективні, диференційно-діагностичні, транспортні, консервуючі, середовища накопичення).

При виділенні чистої культури збудника важливим є створення відповідних умов культивування. До них належить: вибір оптимального поживного середовища (до складу повинні входити органічні речовини, мінерали, фактори росту – вітаміни, пурини, піримідини, жирні кислоти, гліцериди, незамінні амінокислоти); оптимальне рН середовища (7,6); оптимальна температура розвитку (37°С), аеробні або анаеробні умови (залежно від типу дихання).

В патологічному матеріалі мікроорганізми співіснують у різних асоціаціях, що не дозволяє вивчити властивості окремих видів. Для цього їх виділяють у чистій культурі. Чиста культура, або потомство однієї клітини, може бути одержана шляхом механічного розмежування мікроорганізмів, що містяться в інфекційному матеріалі на поверхні твердого середовища.

В ізольованому середовищі бактерії починають рости та розмножуватися. Фази розмноження бактерій:

1. Лаг-фаза – адаптація до нових умов.

2. Експоненціальна фаза – інтенсивне розмноження (збільшення кількості особин в геометричній прогресії).

3. Стаціонарна фаза – кількість відмерлих особин дорівнює кількості живих, що розмножуються.

4. Фаза відмирання – інтенсивне відмирання (кількість відмерлих збільшується в геометричній прогресії).

Культуральні властивості бактерій різні на рідких та щільних поживних середовищах. На рідких середовищах бактерії утворюють:

- помутніння;

- плівку;

- осад;

- їх комбінації.

На твердих середовищах утворюють колонії. Колонія – це видиме неозброєним оком скупчення біомаси бактеріальних клітин на поверхні або в товщі щільного поживного середовища.

На другий день проводять візуальне вивчення результатів висіву досліджуваного матеріалу на пластинчатий агар. Характеристика колоній – своєрідної видимої неозброєним оком сукупності бактерій – є однією з важливих культуральних властивостей, необхідних для ідентифікації бактерій. Візуально та за допомогою стереомікроскопу або малого збільшення світлового мікроскопу вивчаються та описуються властивості ізольованих колоній за наступними ознаками:

• поверхня – гладка(S – форми), шорстка (R – форми), покреслена, горбкувата;

• форма країв – рівні, зазублені, волокнисті, бахромчасті;

• форма – кругла, розеткоподібна, зірчаста, деревоподібна;

• величина – великі (4 – 5мм), середні (2 – 4мм), дрібні (1 – 2мм), карликові (менше 1мм);

• за консистенцією; густиною; кольором; вологими, сухими, слизистими; плоскими, опуклими, куполоподібними, удавленими.

Підозрілу на збудника захворювання колонію, відмічають олівцем по склу, готують з неї мікропрепарат. Висушений та зафіксований препарат фарбують за методом Грама, мікроскопують з метою перевірки на чистоту. Залишок підозрілої колонії висівають на скошений агар для накопичення чистої культури та її подальшого дослідження.

На третій день проведення бактеріологічного дослідження вивчають культуральних властивостей виділеної культури мікроорганізмів на скошеному агарі, а саме однорідність росту (макроскопічне дослідження культури) та перевірка чистоти культури (мікроскопічне дослідження).

При підтверджені чистоти культури виділеного мікроорганізму, проводять визначення біохімічної активності мікробів, що дозволяє встановити вид збудника як етіологічного чинника захворювання. З цією метою проводиться висів дослідного мікроорганізму на диференційно-діагностичні середовища та середовища короткого «строкатого» ряду Гісса. Оцінка біохімічних властивостей мікроорганізмів базується на розчепленні вуглеводів і білкових субстратів, що входять до складу цих середовищ, що дає змогу встановити цукролітичні та протеолітичні властивості бактерій за продуктами ферментації.

Оцінка біохімічних властивостей мікроорганізмів на середовищах Гісса базується на розкладанні вуглеводів до кислоти (зміна кольору індикатора), газоутворення - бульбашки газу у поплавках або в напіврідкому середовищі. Виявити процес розкладу білків з утворенням кінцевих продуктів - сірководню (почорніння індикаторного папірця із ацетатом свинцю), індолу (почервоніння індикаторного папірця із щавлевою кислотою). Середовище Гісса містить лактозу, глюкозу, маніт, мальтозу, сахарозу, МПБ з індикаторними папірцями для виявлення індолу та сірководню. За зміною кольору в пробірках та індикаторних папірців робимо висновок про цукролітичні та протеолітичні властивості досліджуваних мікроорганізмів та проводимо ідентифікацію збудника..

3. Практичні роботи, які виконуються на занятті.

   1. Познайомитись із демонстраційними поживними середовищами та їх класифікацією.

Поживні середовища класифікують наступним чином: -за консистенцією: тверді (МПА), рідкі (МПБ, цукровий бульйон), напіврідкі; - за призначенням: універсальні (МПА, МПБ), селективні (1% лужна пептонна вода), елективні (жовчний бульйон), диференційно-діагностичні (Ендо, Левіна, Плоскірева), спеціальні (кров'яний, сироватковий агар); - за походженням: природні, штучні; - за складом: прості, складні.

2. Приготувати препарати із досліджуваного матеріалу, забарвили за Грамом. Мікроскопічну картину замалювати в протокол.

Мікроскопічна картина: грампозитивні коки, грамнегативні палички.

3. Здійснити посів матеріалу на щільне поживне середовище для механічного роз’єднання бактерій і отримання ізольованих колоній.

4. Підведення підсумків І-го етапу виділення чистої культури збудників. Відомості занести в протокол.

1 етап виділення чистої культури оснований на отриманні ізольованих колоній бактерій на твердому поживному середовищі.

5. На ІІ етапі вивчити морфологічні особливості колоній різних культур бактерій за допомогою демонстраційних посівів на МПА в чашках Петрі (форма, величина, характер країв, прозорість, характер поверхні, наявність пігменту, внутрішня структура та ін.). Відомості занести в протокол.

Визначити кількість морфологічних типів колоній, що виросли на МПА, відмітити характерні ознаки кожного типу колоній.

6. Приготувати мікропрепарат з частини ізольованої колонії та забарвити за Грамом.

Мікроскопічна картина: грамнегативні палички.

7. Переконавшись, що колонія чиста (містить один морфологічний тип бактерій), пересіяти на скошений МПА її залишок. Для цього пропалену бактеріологічну петлю охолодити на внутрішній стінці чашки Петрі, зняти залишок колонії і засіяти зигзагоподібними штрихами на похилий МПА. Посіви підписати і помістити в термостат для інкубації.

8. Ознайомитись з ознаками росту мікроорганізмів на рідких поживних середовищах. Відомості занести в протокол.

На МПБ мікроорганізми утворюють осад, плівку, дифузне помутніння або їх комбінації.

7. Мікроскопічно та візуально перевірити чистоту виділеної культури на скошеному агарі. Для цього приготувати мазок та забарвити за методом Грама. Провести мікроскопічне дослідження за допомогою імерсійної системи.

Мікроскопічна картина: грамнегативні палички.

7. Ознайомитись зі складом демонстраційних диференційно-діагностичних поживних середовищ та ростом мікроорганізмів на них. Відомості занести в протокол.

До складу середовища Ендо входить індикатор фуксин, тому колонії мікроорганізмів, які ферментують лактозу малинового кольору з металевим блиском, лактозо негативні збудники – безбарвні. До складу середовища Левіна входить індикатор метиленовий синій. Лактозо позитивні мікроорганізми формують колонії синьо-фіолетового кольору, лактозо негативні – безбарвні. Середовище Плоскірєва містить індикатор нейтральний червоний, тому колонії лактозо позитивних штамів мають червоний колір, лактозо негативних – безбарвні.

7. Вивчити склад середовища короткого строкатого ряду Гіса, та в демонстраційному досліді. Врахувати зміни в пробірках, викликані бактеріями. Відомості занести в протокол.

Дослідний мікроорганізм ферментував лактозу, глюкозу, маніт, мальтозу, про що свідчить зміна кольору в пробірках з червоного на жовтий. В пробірці з сахарозою колір середовища залишився не змінним. Пептолітичні властивості наступні: почорніння індикаторного папірця з ацетатом свинцю на виявлення сірководню, та почервоніння індикаторного папірця із щавелевою кислотою на виявлення індолу.

7. В демонстраційному досліді врахувати амілолітичні та гемолітичні властивості бактерій. Оформити протокол.

Для визначення амілолітичних властивостей використовують середовище з крохмалем. В якості індикатора виступає розчин Люголя. Синій колір середовища буде свідчити про відсутність амілолітичних властивостей мікроорганізмів.

Для визначення гемолітичних властивостей дослідні мікроорганізми висівають на кров'яний агар. Наявність зон просвітлення (гемолізу) навколо колоній свідчить про наявність гемолітичних властивостей.

7. Познайомитись з експрес-методом вивчення біохімічних властивостей бактерій за допомогою комплекту „Ентеротест І”, „Ентеротест ІІ”, системою індикаторних папірців.

8. Оформити протокол. Зробити висновки.