Методи оцінки результатів

Для характеристики росту культур in vitro в першу чергу визначають збільшення сирої маси (W_t–W_o). Результати можуть бути виражені відносно вихідної маси . Це дозволяє встановити у скільки разів збільшилася маса протягом досліду. Величину приросту маси можна виразити у відсотках. Якщо тривалість росту в окремих випадках неоднакова, необхідно ввести у формулу фактор часу.

Таким же чином можна проводити облік результатів за масою сухої речовини.

Більше інформації про характер росту культури отримують при визначенні числа клітин на одиницю маси тканини. Підрахунок клітин дозволяє визначити збільшення маси тканини відбувається за рахунок поділу клітин чи їх росту. Це дає можливість розрахувати і середню вагу клітини. Кількість клітин визначають за методом розробленим Брауном, який полягає у мацерації і послідуючому підрахунку краплі суспензії клітин у лічильній камері під мікроскопом. Використовують кілька методів мацерації. Більшість з них базується на обробці тканин сильними кислотами, які гідролізують серединні пластинки, що з’єднують клітини.

Для суспензійних культур визначають об’єм ущільнених клітин. Для цього в градуйовані центрифужні пробірки переносять певний об’єм суспензії (15 – 30 мл) і центрифугують при 1500g 10 хв або суспензію поміщають в градуйований циліндр і відстоюють впродовж доби. Об’єм ущільнених клітин виражають в мл клітинного осаду на мл культури.

Розмір клітин визначають вимірюючи їхню довжину та ширину під мікроскопом за допомогою шкали окуляр-мікрометра та об’єкт мікрометра.

Контрольні запитання і завдання

1. Що таке калюс?

2. Які зміни відбуваються у спеціалізований клітині при переході до дедиференціації?

3. Із яких органів рослини можна отримати калюсну тканину?

4. Яка основна особливість середовища для калюсогенезу у злаків?

5. Назвіть типи калюсної тканини.

6. Яке практичне використання пухких калюсів?

7. Який тип калюсної тканини Ви б використали для отримання рослин-регенерантів?

8. Наведіть приклади можливого використання калюсної тканини.

9. Що таке клітинна суспензія та яке її практичне значення?

10. Калюсній тканині якого типу надається перевага для отримання клітинної суспензії?

11. Назвіть методи культивування одиночних клітин.

12. Які показники визначають для оцінки росту суспензійної культури?

Мікроклональне розмноження рослин

Біотехнологія рослин найширше використовується у агротехніці для прискореного розмноження і оздоровлення цінних сортів сільськогосподарських культур. На основі цієї технології створена ціла індустрія мікроклонального розмноження рослин.

Мікроклональне розмноження - це безстатеве вегетативне розмноження в культурі in vitro , при якому отримують рослини генетично ідентичні вихідній батьківській формі, що сприяє збереженню генетично однорідного посадкового матеріалу. Цим методом можна розмножувати у короткі строки види, які важко розмножуються і рослини, які є в одному екземплярі, а також і стерильні генотипи. Особливої актуальності сьогодні набули дослідження по розробці методів мікроклонального розмноження рідкісних та зникаючих рослин. Багаточисельність, швидкість і високий коефіцієнт розмноження (1:1 000 000 ) дозволяє у 2–3 рази скоротити термін відбору і отримання нових рослин у селекційних дослідженнях.

Мікроклональне розмноження має цілий ряд переваг над традиційними методами розмноження рослин:

1) економія вихідного матеріалу;

2) отримання великого числа копій із мінімальної кількості рослинного матеріалу;

3) отримання генетично однорідного матеріалу;

4) можливість відбирати in vitro рослинний матеріал з бажаними ознаками;

5) можливість отримання безвірусного матеріалу;

6) можливість проводити розмноження рослин протягом цілого року, адже їх ріст і розвиток in vitro практично не залежать від сезону;

7) можливість отримувати у великих кількостях вегетативне потомство видів рослин, що важко розмножуються у звичайних умовах;

8) економія площі;

9) можливість тривалого збереження пробірочних рослин при понижених температурах, що дає змогу створити банк цінних форм рослин.

Теорією і принципом розробки технології мікроклонального розмноження є положення про можливість індукції диференціації і органогенезу, виникнення біологічної форми із однієї рослинної клітини, її здатності утворювати цілу рослину. Клітина in vivo у складі тканини з певною диференціацією виконує вузьку специфічну функцію. Реалізація її тотипотентності in vivo послаблюється факторами і умовами, які мають місце на материнській рослині. Якщо ж клітина вилучається із рослини і поміщається у штучні контрольовані умови in vitro, то реалізується потенційна можливість відновлення рослини із клітини або групи клітин, тобто реалізується властива клітині тотипотентність. Прояв цієї властивості поки що виявлено у клітин, які називаються меристемоїдами.

Меристемоїди – це морфогенетично компетентні клітини, які відповідають на індуктори диференціації і склад середовищ формуванням пагонів, коренів, зародка. Морфологічно їх виявляють у калюсних культурах у компактних осередках клітин, що діляться, у вигляді дрібних, ізодіаметричних, тонкостінних клітин з великим ядром, густою цитоплазмою і практично без вакуолей. Саме з таких клітин складаються апікальні меристеми і клітини зародка. У тканинах, які отримали з цих органів найлегше індукувати органогенез.

У зв’язку з цим регенерація із будь-яких клітин рослин можлива, якщо вдасться перевести ці клітини у меристемоїди, створивши відповідні умови.

Навіть у рослин з високим ступенем регенерації, наприклад у тютюну, клітин-меристемоїдів не так багато: у первинному калюсі на 1000 – 10000 клітин може бути один меристемоїд. Розподіл меристимоїдів по органах рослин нерівномірний, і різні види відрізняються за вмістом меристемоїдів у тканинах окремих органів. У зв’язку з цим першочерговим завданням є вибір частини рослини, яку можна використати як первинний експлантат. Найвищий ступінь регенерації виявлений у зародків, сім’ядолей, гіпокотилів, коренів, стебла, листка, бульб, суцвіття і пиляків.

Встановлено, що у багаторічних рослин, як і у однорічних, прояв тотипотентності клітин у тканинах і органах поточного року знижується на пізніших етапах. Це може свідчити про зниження у рослині концентрації меристемоїдів з віком або про поступове зниження їх компетентності. Так, регенерація рослин кукурудзи або кофе можлива із калюсу, який отримують із незрілих зародків, які виділені задовго до дозрівання насіння. Загальновідомо, що культури тканин, які отримали із молодих листків або стебел краще здатні до регенерації рослинок. Крім цього, розвиток рослини супроводжується зниженням здатності тканин до ембріогенезу або органогенезу. Культури тканин, які отримали із дорослих рослин, звичайно не здатні до регенерації, а тому первинні експлантати деревних необхідно відбирати на ювенільних фазах розвитку.

Кількість меристемоїдів можна збільшити їх відбором. Крім того, для подальшого розвитку меристемоїдів їх необхідно відділити від немеристемоїдних клітин, так як остані пригнічують ембріогенез у цих клітин, можливо, виділяючи інгібітори. Необхідність відбору меристемоїдів обумовлена і тим, що при тривалому культивуванні тканин зменшується здатність до регенерації.

Кількість меристемоїдів і реалізація тотипотентності у значній мірі залежать від умов, у які поміщають клітину перед або під час індукції регенерації. Серед них найважливішими є: освітлення, температура і склад середовища.

Сезонні зміни поведінки ізольованих тканин звичайно пов’язані із змінами фотоперіоду і температури. Відмічено, що вміст меристемоїдних клітин і найвищий ступінь регенерації спостерігаються в разі вирощування донорних рослин при оптимальних для даного виду фотоперіоді і температурі. Експлантати, відібрані від рослин, які росли при несприятливому фотоперіоді, утворюють мало або зовсім не утворюють регенерантів, навіть якщо фотоперіод при культивуванні буде оптимальним. У більшості лабораторій стандартом є 16–годинний фотоперіод, оптимальна інтенсивність освітлення 1000 Лк. Соматичний ембріогенез, як правило, відбувається в темряві – на світлі зародки передчасно проростають. Однак відомі випадки коли соматичний ембріогенез у калюсу Nicotiana стимулювало освітлення 10000 – 15000 Лк. Значення має і спектральний склад світла: утворення адвентивних пагонів у Nicotiana tabacum найкраще відбувається при освітленні калюсу ультрафіолетовою частиною спектра (371 нм), голубою (419 – 467 нм) або пурпурною (504 – 550 нм). У іншого виду Lactuca sativa утворення пагонів стимулювало освітлення червоним світлом (660 нм) і індукція знімалась при освітленні дальнім червоним (750 нм).

Для отримання великої кількості меристемоїдних клітин і прискорення органогенезу у різних видів рослин є температурні оптимуми. З метою індукції прискорення органогенезу застосовують обробку тканин листків або стебел субоптимальними температурами (15–18° С), що покращує регенерацію при подальшому культивуванні при 21–25° С. Для деяких рослин більш ефективною є короткочасна обробка нижчою температурою (4° С).

Важливу роль у регулюванні реалізації тотипотентності рослинною клітиною відіграють біологічно активні речовини фітогормональної дії, що входять до складу середовища, а саме, ІОК і цитокініни.

Отже, для успішної реалізації рослинною клітиною властивої їй тотипотентності необхідно враховувати такі моменти:

1) вибір первинного експлантата;

2) сезонність, вік первинного експлантата;

3) умови культивування експлантатів.