Добавил:
Sekretar
kiopkiopkiop18@yandex.ru
t.me/Prokururor I Вовсе не секретарь, но почту проверяю
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Ординатура / Хирургия / Библиотека им академика М.И. Перельмана / Книга_2710_Библиотеки_им_академика_М_И_Перельмана
.pdf
150
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Глава 1. Общеклинические методы исследования кров и
познавание и элиминацию генетически чужеродных структур, являясь, таким образом,
важнейшим фактором, регулирующим постоянство внутренней среды организма. Нарушения функции иммунной системы могут приводить к ослаблению защиты организма от
чужеродных агентов (вирусов, бактерий, клеток опухолей и т.д.) и развитию иммунодефицитных состояний. С другой стороны, дисбаланс между отдельными звеньями иммунной
системы (например, между Т- и В-системами иммунитета) может явиться причиной развития аутоиммунных, аллергических заболеваний и так называемых болезней иммунных
комплексов. Наконец, состояние иммунной системы имеет прямое отношение к реакции
отторжения ауто- и аллотрансплантатов органов и тканей.
Запомните: Наиболее общими показаниями для исследований иммунной системы являют-
ся (В.А.Казанцев и С.В.Болл):
• подозрение на наличие врожденного или приобретенного иммунодефицитного состояния;
• аутоиммунные заболевания;
• аллергические заболевания;
• инфекционные заболевания с затяжным и хроническим течением;
• злокачественные новообразования;
• контроль за проведением терапии цитостатиками, иммунодепрессантами и иммуномодулирующими препаратами;
• обследование реципиентов до и после аллотрансплантации органов;
• подготовка к серьезным хирургическим вмешательствам.
1.5.1. Общие положения
Разнообразные иммунные реакции организма осуществляются посредством функциони
рования четырех тесно связанных между собой компонентов иммунной системы: 1) не-
специфической гуморальной системы защиты (системы комплемента и так называемых
острофазных белков плазмы); 2) специфической системы гуморального иммунитета,
реагирующей на внедрение чужеродного агента образованием специфических антител
3) специфической системы клеточного иммунитета (Т-лимфоциты); 4) неспецифическо
клеточной системы иммунитета (фагоцитоз).
Центральное место в функционировании этих четырех компонентов иммунной систе
мы занимает лимфатическая система. В зависимости от функций и, соответственно, хи
мических и морфологических особенностей оболочки различают три типа лимфоцитов.
В-лимфоциты, Т-лимфоциты и О-лимфоциты («нулевые» клетки). Они развиваются г
одного предшественника - лимфоидной стволовой клетки, которая, в свою очередь, проис
ходит от гемопоэтических стволовых клеток.
Созревание и дифференцировка В- и Т-лимфоцитов осуществляется в централь-
ных (первичных) лимфоидных органах - тимусе (Т-лимфоциты) и костном мозг
(В-лимфоциты). Оба типа лимфоцитов приобретают здесь характерные для них функци
нальные и морфологические особенности, т.е. становятся коммитированными.
Коммитированные В- и Т-лимфоциты переносятся с током крови к периферическим
(вторичным) лимфоидным органам (лимфоузлам, селезенке, лимфоидной ткани кишеч
ника и т.д.). Здесь при первом контакте с антигеном В-лимфоциты быстро пролифериру
ют, растут и трансформируются в плазматические клетки, которые осуществляют синте
и выделение специфических гуморальных антнтел - иммуноглобулинов различных клас
сов (IgG, IgM, IgA, IgE, IgD). Синтезированные антитела специфичны только к антиге
вызвавшему активацию В-лимфоцита. Трансформация коммитированных В-лимфоцито
в иммунокомпетентные плазматические клетки, т.е. клетки, способные распознавать чуже
родные антигены и вызывать специфические иммунные реакции, находится под контроле:
1.5. Иммунологические исследования
151
Т-лимфоцитов, часть которых (Т-хелперы - см. ниже) выделяют регуляторные тканевые
гормоны - цитокины. Контроль активации В-лимфоцитов осуществляется также макрофагами, выделяющими монокины (например, интерлейкин-1). Часть активированных
В-лимфоцитов превращается в так называемые В-клетки памяти, длительно сохраняющие
на своих мембранах информацию об антигене и передающие ее своим дочерним клеткам.
Т-лимфоциты не способны вырабатывать антитела. Они отвечают за клеточный иммунный ответ. После активации антигеном Т-лимфоциты превращаются в иммунокомпетентные Т-эффекторы, или Т-клетки памяти. Т-эффекторы образуют на своей поверхно-
сти рецепторы антигена, что позволяет им вступать в специфические иммунные реакции
с данным антигеном. В зависимости от характера такой реакции и функции Т-эффектора
различают несколько субпопуляций этих клеток:
1. Т-киллеры («убийцы») - иммунокомпетентные Т-лимфоциты, способные распознавать
и уничтожать клетки, несущие на себе признаки чужеродного антигена.
2. Т-хелперы (помощники) - клетки, активирующие выработку антител плазмоцитами.
3. Т-супрессоры - клетки, тормозящие активность В- и Т-лимфоцитов (в частности, синтез иммуноглобулинов) и предупреждающие таким образом чрезмерные иммунные ре-
I акции.
I Запомните: 1. Основной функцией иммунокомпетентных В-лимфоцитов (плазматиче-
ских клеток) является выработка антител (иммуноглобулинов), которая регулируется
Т-хелперами (активация В-лимфоцитов), Т-супрессорами (подавление синтеза антител),
макрофагами (активация В-лимфоцитов) и некоторыми другими агентами (гуморальный
иммунный ответ).
I 2. Основной функцией иммунокомпетентных Т-лимфоцитов являются реакции специфи-
. ческого клеточного иммунитета: распознавание и уничтожение чужеродных клеток
I Т-киллерами (гиперчувствительность замедленного типа, противораковая защита, рези-
стентность к бактериальным и вирусным агентам, реакция отторжения аллотрансплантатов) и регуляция выработки антител плазматическими клетками (Т-хелперы и Т-су-
I прессоры).
В периферической крови на долю В-лимфоцитов приходится 15-35%, а Т-лимфоцитов -
около 50-70% всех лимфоцитов. Еще около 10% лимфоцитов представлено так называемыми О-лимфоцитами («нулевыми» клетками), отличающимися по своим поверхностным
свойствам как от В-лимфоцитов, так и от Т-лимфоцитов. Часть этих клеток несет на своей
поверхности рецепторы для IgG. Они уничтожают любые клетки, на поверхности которых
присутствует IgG. К «нулевым» клеткам относятся также так называемые естественные
етки-киллеры, действующие независимо от наличия антител.
Таким образом, функционирование В- и Т-лимфоцитов обеспечивает специфический
оральный и клеточный иммунитет. Большое значение в механизме защиты от чужерод-
ных агентов имеют также факторы неспецифического гуморального и клеточного имму-
тета.
1.5.2. Неспецифическая гуморальная система защиты
Факторы неспецифической гуморальной защиты обеспечивают так называемый острофазный ответ организма при действии внешних (вирусная или бактериальная инфекция,
операции, ожоги и т.д.) или внутренних (инфаркт ткани, злокачественные новообразования, аутоиммунные процессы, образование иммунных комплексов) причин. Острофазный ответ организма способствует прямому уничтожению чужеродных агентов, а также
ивации процессов воспаления и специфической иммунной защиты и сопровождается
152
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Глава 1. Общеклинические методы исследования кров и
существенными сдвигами всех метаболических процессов и функционального состояния
эндокринной, нервной систем, системы терморегуляции и т.д.
К числу острофазных белков, ответственных за реализацию неспецифической гумо-
ральной защиты, относят: 1) систему комплемента; 2) С-реактивный белок; 3) фибриноген;
4) агантитрипсин; 5) оц-кислый гликопротеид; 6) гаптоглобин; 7) агхимотрипсин; 8) сывороточный белок амилоидов А и Р; 9) интерфероны; 10) лизоцим. Важнейшими из них
являются система комплемента и С-реактивный белок.
Комплемент представляет собой систему из девяти плазменных белков (С1-С9), играющих существенную роль в развитии иммунных и воспалительных реакций. В норме эи
вещества присутствуют в крови в неактивном состоянии - в виде так называемых энмо
генов. Их последовательная активация происходит под действием иммунных комплексе!
антиген-антитело («классический путь» активации), а также некоторых продуктов жизнедеятельности бактерий, грибов, паразитов, вирусов, лимфобластов, агрегирующих белки и
иммуноглобулины с участием пропердина («альтернативный путь»). Активация компле
мента возможна также агрегатами IgG, IgM, С-реактивным белком, ДНК, плазминогеном и
другими агентами. Классический путь активации связан, таким образом, с наличием в ор
ганизме антител и образованием иммунных комплексов, а альтернативный путь не зависит
от наличия специфических антител.
Биологические эффекты системы комплемента многообразны:
• усиление фагоцитоза;
• усиление хемотаксиса;
• повышение проницаемости капилляров;
• активация гранулоцитов и макрофагов и развитие воспалительной реакции;
• агрегация чужеродных клеток (иммунная адгезия);
• опсонизация (изменение свойств поверхности чужеродных клеток, при котором они
становятся более доступными для фагоцитоза);
• разрушение вирусов и пораженных вирусами клеток;
• индуцирование выделения тучными клетками и базофилами гистамина при при
соединении некоторых фрагментов - пептидов, образующихся при активации комплемента;
• индуцирование выделения серотонина тромбоцитами;
• цитолиз - лизис клеток, на которых фиксирован комплемент, в том числе бактерий i
собственных клеток с измененными антигенными свойствами.
Следует добавить, что гемолитические, цитотоксические и некоторые другие эффекгь
антител реализуются только в присутствии комплемента.
Таким образом, система комплемента обеспечивает:
• прямой лизис чужеродных клеток;
• стимуляцию фагоцитарной активности нейтрофилов и макрофагов;
• развитие воспалительной реакции',
• участие в формировании иммунных комплексов, активирование и усиление иммун
ного лизиса чужеродных клеток.
С-реактивный белок (СРБ) - это один из ведущих компонентов острофазной реак
ции. Основная биологическая функция этого белка состоит в связывании с фосфохоли
новыми соединениями, широко представленными на мембранах бактерий, а также с не
которыми белками, освобождающимися в любой поврежденной ткани. Будучи связанным
с каким-либо лигандом, СРБ: 1) принимает участие в осаждении, агглютинации, капсуляр
ном набухании и фагоцитозе бактерий; 2) эффективно активирует систему комплемента
способствуя, таким образом, развитию воспаления. С-реактивный белок в ничтожных ко
личествах присутствует в сыворотке здорового человека, хотя обычными лабораторным!
методами, как правило, не выявляется. При попадании в организм каких-либо экзогенны;
антигенов (например, бактерий) или высвобождении продуктов деструкции собственны)
клеток его концентрация возрастает в сотни раз.
1.5. Иммунологические исследования
153
Методы исследования
Реакция связывания комплемента. Общую активность системы комплемента определяют в так называемой гемолитической системе по реакции связывания комплемента. Гемолитическая система представляет собой смесь эритроцитов барана и стандартной специфической антисыворотки, содержащей антитела к этим эритроцитам, но искусственно лишенной собственного комплемента. В такой системе гемолиза эритроцитов не происходит
в связи с отсутствием важного звена процесса связывания антител с антигеном - комплемента, разрушенного предварительным нагреванием. Если в такую систему добавить исследуемую сыворотку больного, содержащую комплемент, образуется иммунный комплекс
и происходят склеивание и гемолиз эритроцитов. Чем больше концентрация комплемента
в исследуемой сыворотке, тем более выражен гемолиз эритроцитов.
В норме уровень комплемента сыворотки крови составляет 20-40 гемолитических единиц. При острых инфекционных и воспалительных заболеваниях наблюдается, как правило, увеличение активности комплемента, при хронических — ее снижение,
i Низкие значения гемолитической активности могут отражать врожденную или при-
обретенную недостаточность отдельных компонентов системы комплемента. Следует отыетить, что дефекты данной системы рассматриваются как самые частые наследственные
аномалии белков человека. Они могут играть патогенетическую роль при следующих заболеваниях и синдромах:
1. Рецидивирующие бактериальные пиогенные инфекции органов дыхания, кожи и друI гих органов: пневмонии, бронхоэктазы, рецидивирующий синусит, пиодермия, генераI лизованные бактериальные инфекции, септицемия.
2. Рецидивирующие менингококковые и гонококковые инфекции (менингококковый ме-
I нингит, диссеминированные гонококковые инфекции, гонококковые артриты и др.).
3. Аутоимунные, аллергические заболевания и болезни иммунных комплексов: системI ная красная волчанка, дерматомиозит, мембранопролиферативный гломерулонефрит,
I болезнь Шенлейна-Геноха, синдром Шегрена, тромбоцитопеническая пурпура, склеI родермия, ювенильный ревматоидный артрит, рецидивирующий ангионевротический
I отек (особенно часто - ларингоспазм), дерматозы, фоточувствительность и др.
I С-реактивный белок. Наиболее простым и распространенным способом определения
С-реактивного белка является метод кольцепреципитации в капиллярах. Метод основан на
выявлении хлопьевидного преципитата при взаимодействии исследуемой сыворотки крови (или другой биологической жидкости) со специфической иммунной антисывороткой,
содержащей антитела к СРВ. Характер и интенсивность реакции оцениваются через 24 ч
от начала исследования по высоте столбика преципитата (в мм) в капилляре, в котором
перемешаны исследуемая сыворотка и антисыворотка. Каждый 1 мм столбика преципитата оценивается как «+».
I В норме С-реактивный белок в сыворотке крови отсутствует. Только при использова-
нии метода радиоиммунного анализа в сыворотке здорового человека можно выявить до
8 мг/л СРВ. Его появление (или повышение) в крови неспецифично и наблюдается при любых острых инфекционных, воспалительных и дегенеративных процессах. Концентрация
СРБ в сыворотке крови хорошо коррелирует с активностью воспалительного процесса и
епенью деструкции тканей.
1.5.3. Гуморальный специфический иммунитет
Гуморальный специфический иммунитет осуществляется благодаря образованию антител
плазматическими клетками в ответ на антигенную стимуляцию В-лимфоцитов.
Антитела представляют собой иммуноглобулины, относящиеся к гамма-фракции сывоочных белков. Из пяти изученных в настоящее время классов иммуноглобулинов наи-
льшее практическое значение имеют три класса: IgG, IgM и IgA. На их долю приходится
ветственно 80, 5 и 15% всех сывороточных иммуноглобулинов.
154
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Глава 1. Общеклинические методы исследования кров и
Каждый класс включает большое число поликлональных антител, сходных по струил
ре. Все антитела имеют два фрагмента (рис. 1.105): 1) Fab-фрагмент - участок иммуногл
булина, связывающий специфический антиген; 2) Fc-фрагмент - часть иммуноглобулин
которая не связывается с антигеном, но взаимодействует в процессе иммунной реакци
с макрофагами, лимфоцитами и факторами комплемента.
Иммуноглобулины всех классов состоят из молекул легких и тяжелых цепей поли
пептидов. Легкие цепи одинаковы для всех иммуноглобулинов. Тяжелые цепи различнь
классов иммуноглобулинов отличаются по первичной структуре и антигенным свойства
Иммуноглобулины IgG - основной компонент у-глобулиновой фракции плазмы кр
ви. Содержание IgG в плазме крови достигает 80% всех иммуноглобулинов (7,0-16,0 г/л
Это самые мелкие антитела (молекулярная масса 150-10 3), которые могут проникать че~"
плаценту. Помимо непосредственного взаимодействия с антигеном и образования иммун
ного комплекса, IgG участвуют в активации системы комплемента, а также стимулиру
процесс фагоцитоза, являясь важнейшими опсонинами (см. ниже).
Иммуноглобулины IgM - самые крупные антитела (молекулярная масса до 900-10
относящиеся к Р-фракции глобулинов. На их долю приходится около 5% всех иммуногл
булинов сыворотки крови. В норме содержание IgM составляет 0,4-2,3 г/л. IgM способн
нейтрализовать достаточно крупные инородные частицы, вызывая их агглютинацию и п
ципитацию, в том числе агглютинацию эритроцитов. К IgM принадлежат антитела прот
полисахаридных антигенов, О-антигенов грамотрицательных бактерий, гемагтлютинин
холодовые агглютинины, ревматоидный фактор и др. Кроме того, некоторые подкласс
IgM активируют систему комплемента.
Иммуноглобулины IgA с молекулярной массой от 160 до 320-10 3 в норме составля
около 15% всех иммуноглобулинов. В норме содержание IgA составляет 0,7^1,0 г/л. Он
в большом количестве содержатся в секрете пищеварительного и респираторного тракт
в слюне, играя значительную роль в формировании местного иммунитета и обеспечи
защиту против антигенов, контактирующих со слизистыми оболочками. Кроме того, Ig
участвуют в активации системы комплемента по альтернативному пути.
Иммуноглобулины IgE присутствуют в плазме в малых количествах. Важнейше
функцией IgE является способность связываться с тучными клетками и базофильными грнулоцитами. Как только такие фиксированные IgE контактируют с соответствующим анти
3
Легкая цепь
Тяжелая цепь
Связь
с антигеном
с комплементом
с рецепторами Fc Рис. 1.105. Схема строения имму-
ноглобулина IgG.
1.5. Иммунологические исследования
155
геном, тучные клетки секретируют гистамин, серотонин и другие биологически активные
вещества, запуская аллергическую реакцию немедленного типа.
В результате реакции между антигеном и антителом образуются иммунные комплек-
сы антиген-антитело, которые так или иначе обеспечивают обезвреживание и нейтра-
изацию чужеродного антигена. Если образовавшиеся молекулярные агрегаты антигеннтитело имеют достаточно большие размеры, они выпадают в осадок - происходит их
преципитация. В том случае, когда антиген представлен чужеродной клеткой (эритроцит,
актерия), в результате образования на ее поверхности комплекса антиген-антитело изменяются физико-химические свойства клеточной мембраны и при условии крупных размеров антитела (IgM) происходит «склеивание» (агглютинация) клеток. Если же антитело
имеет относительно малые размеры (например, IgG), то образовавшийся на поверхности
клетки иммунный комплекс не способен вызвать их агглютинацию. В этом случае речь
идет о так называемых неполных антителах, которые блокируют чужеродные антигены
ак, что они не могут взаимодействовать с полными антителами. Агглютинацию таких кле-
к можно вызвать, добавив к ним так называемые гетерологические антитела, т.е. анти-
ела против иммуноглобулинов человека (например, реакция Кумбса — см. ниже).
При повторном внедрении в организм чужеродного агента специфический гумораль-
ый иммунитет обеспечивает иммунные реакции немедленного типа, в том числе проис-
ходящие на поверхности базофильных и тучных клеток. В этих случаях антиген реагирует
с IgE, фиксированным на поверхности этих клеток. В результате секретируется большое
личество биологически активных веществ (гистамин, серотонин и др.).
Причинами увеличения содержания иммуноглобулинов IgG, IgM и IgA, выполняю-
их функцию защиты организма от действия бактерий, вирусов, токсинов и других внеш-
них и внутренних факторов, обладающих антигенными свойствами, являются:
• острые бактериальные, вирусные, паразитарные, грибковые инфекции;
• острые и хронические заболевания печени, почек;
• многочисленные аутоиммунные заболевания;
• ревматоидный артрит;
• системная красная волчанка;
• другие коллагенозы и системные васкулиты;
• миеломная болезнь;
• макроглобулинемия Вальденстрема;
• гемобластомы;
• острый и хронический лимфолейкоз;
• лимфомы, саркомы;
• кандидоз, муковисцидоз;
• болезни органов дыхания;
• аутоиммунные заболевания кишечника и многие другие.
По сути, нет заболеваний внутренних органов, которые не сопровождались бы в боль-
шей или меньшей степени активацией системы гуморального иммунитета. В некоторых
"учаях оценка содержания отдельных иммуноглобулинов в сыворотке крови помогает
роводить дифференциальную диагностику различных заболеваний внутренних органов
(см. табл. 1.18).
Снижение содержания иммуноглобулинов IgG, IgM и IgA свидетельствует о недоста-
чности гуморального иммунитета, причинами могут явиться:
• хроническая вирусная или бактериальная инфекция;
• длительное лечение цитостатиками, иммунодепрессантами, некоторыми антибиотиками;
• действие ионизирующей радиации;
• новообразования иммунной системы;
• хронические заболевания кишечника воспалительной природы;
• заболевания, сопровождающиеся гипопротеинемией;
156
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Глава 1. Общеклинические методы исследования кров и
Изменение содержания иммуноглобулинов при некоторых заболеваниях внутренних органов
Острая инфекция
Хронические инфекции
Ревматоидный артрит
Системная красная волчанка
Склеродермия
Смешанные заболевания соединительной ткани
(синдром Шарпа)
Острый вирусный гепатит т
Хронический гепатит
Первичный биллиарный цирроз печени
Алкогольный цирроз печени
Острый пиелонефрит
Хронический пиелонефрит
Нефротический синдром
и инфекциях (Белевитин А.Б., Щербак С.Г., 2006; в модификации)
Заболевания
IgG IgA IgM
Норма Норма Т или ТТ
Т или ТТ
Норма или Т1 Норма или Т1 Норма или Т
t
Норма Норма Норма
Норма или Т Норма или Т Норма
Норма или Т Норма
Норма или t Норма Т или ТТ
Норма или t
Норма Норма Т или ТТ
t или ТТ Норма
4 1
Норма или Т Норма или Т
Норма Норма или Т
Норма или Т Норма или Tt
ТТ
Таблица 1.18
Норма или Т
Норма или Т
Т или ТТ
Норма или 1
• удаление селезенки;
• врожденная или приобретенная гипогаммаглобулинемия;
• гемоглобинопатии и др.
Определение повышенного уровня иммуноглобулина IgE имеет важное диагностическое значение при заболеваниях, сопровождающихся развитием иммунных реакций немедленного типа (Белевитин А.Б., Щербак С.Г., 2006):
• атопическая бронхиальная астма;
• атопический дерматит;
• аллергический ринит;
• аллергическая гастроэнтеропатия;
• анафилактический шок;
• ангионевротический отек;
• аллергический бронхопульмональный аспергиллез;
• гельминтозы;
• ranep-IgE-синдром (синдром Джоба);
• синдром Вискотта-Олдрича;
• тимусная аплазия (синдром Ди-Джорджи);
• IgE-миелома;
• реакция «трансплантат против хозяина».
Методы исследования
Исследование специфического гуморального иммунитета включает: 1) определение содержания в сыворотке крови иммуноглобулинов различных классов; 2) специфических антител; 3) циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК); 4) некоторых антигенов.
Определение иммуноглобулинов
Определение иммуноглобулинов - один из наиболее распространенных методов исследо-
вания гуморального иммунитета. Для количественной оценки иммуноглобулинов сыворотки крови чаще всего используют методы: 1) радиальной иммунодиффузии; 2) иммуноэлектрофорез; 3) метод иммунофлуоресценции.
1.5. Иммунологические исследования
157
Метод радиальной иммунодиффузии. Принцип наиболее простого и распространенного метода радиальной иммунодиффузии заключается в оценке диаметра колец преципитации, возникающих при взаимодействии в геле антигена (в данном случае иммуно-
лобулина исследуемой сыворотки) и антитела (антител к иммуноглобулинам человека,
одержащимся в стандартных антисыворотках).
Стандартные антисыворотки с антителами к IgG, IgM, IgA смешивают с растопленным
агаром. Эту смесь заливают на специальные пластины. После ее застывания на каждой пла-
"ине специальным пробойником делают 35 лунок диаметром 2 мм (рис. 1.106, а). В лунки
кропипеткой вносят по 2 мкл последовательных разведений (1:1,1:2,... 1:8) стандартной
ыворотки с известной концентрацией иммуноглобулинов, а также такое же количество раз-
•дений исследуемой сыворотки (с неизвестным содержанием иммуноглобулинов).
Пластины инкубируют при 4°С в течение 24 ч и затем оценивают результаты. Антиген
[ (иммуноглобулин стандартной или исследуемой сыворотки) диффундирует в слое агара,
содержащего антитела к человеческим иммуноглобулинам, в результате чего вокруг лунок
бразуются кольца преципитации (рис. 1.106, б). Чем выше концентрация иммуноглобули-
нов, тем больше диаметр кольца. Вначале оценивают размеры колец преципитации вокруг
нок, в которые были внесены стандартные сыворотки различного разведения с извест-
ной концентрацией иммуноглобулинов. По этим результатам строят кривую, отражающую
"висимость между диаметром (площадью) кольца преципитации и концентрацией имму-
ноглобулина (рис. 1.106, в). Такую кривую строят для каждой пластины. Затем измеряют
иаметр колец преципитации в испытуемом препарате и по стандартной калибровочной
"ивой определяют искомую концентрацию иммуноглобулинов.
Для количественного определения IgE, присутствующего в сыворотке крови в низких
концентрациях, применяют более точные методы радиоиммунного или иммунофермент-
ного анализа (см. ниже).
Исследуемая
сыворотка
Стандартная сыворотка
с 1д (антигены)
П I I I) t
Слой агара с антителами к 1д
(стандартная антисыворотка)
Кольца преципитации
Диаметр
колец
преципитации
1 1 г
Концентрация иммуноглобулина
Рис. 1.106. Схема определения концентрации иммуноглобулинов методом радиальной иммунодиффузии.
а - внесение стандартной и исследуемой сыворотки в лунки пластины с залитым агаром, содержащим антитела к имуноглобулинам; б - фрагмент пластины после инкубации (видны кольца
преципитации, диаметр которых зависит от
концентрации иммуноглобулинов); в - калибро-
вочная кривая зависимости диаметра колец преципитации от концентрации иммуноглобулинов
стандартной сыворотки.
158
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Глава 1. Общеклинические методы исследования
кров
и
Иследуемая сыворотка (антиген)
Метод иммуноэлектрофореза исполь
зуется в основном для определения моно
клоналъных иммуноглобулинов, наприме]
парапротеинов при миеломной болезни шл
макроглобулинемии Вальденстрема. Мето]
представляет собой сочетание электрофо
ретического разделения белков сыворотю
крови (или других биологических сред) \
Белки сыворотки
ft
последующей радиальной иммунодиффу
зии с образованием преципитатов.
Для проведения реакции расплавлении
агар наносят на предметное стекло и делаю
в нем лунку (рис. 1.107, а). В лунку внося;
Стандартная антисыворотка
с антителами к искомым антигенам
исследуемую сыворотку и пластину помещают в электрическое поле, под действие!
которого происходит разделение различны
белков сыворотки крови (рис. 1.107, б). П|
окончании электрофореза в агаровой пла
стине вырезают траншею, в которую внося
стандартную антисыворотку, содержа
щую антитела к определенным антигена1
(например, парапротеину) (рис. 1.107,
Белки (антиген)
Если в исследуемой сыворотке имеются ис
комые антигены (парапротеин), уже чере
несколько суток в агаровом слое образую
ся полосы преципитации (рис. 1.107, г).
Метод иммуноэлектрофореза чаще ис
Антисыворотка (антитела)
Рис. 1.107. Схема метода иммуноэлектрофореза.
а - внесение в лунку исследуемой сыворотки с искомым антигеном; б - электрофоретическое разделе-
ние белков исследуемой сыворотки; в - внесение
в траншею стандартной антисыворотки с антите-
лами к искомому антигену; г - появление дуг пре-
ципитации при наличии в исследуемой сыворотке
искомого антигена.
пользуется для идентификации низких кои
центраций парапротеина при миеломно
болезни, макроглобулинемии Вальденстр*
ма и т.д.
Обнаружение аутоантител
При некоторых заболеваниях внутренн
органов, в развитии которых имеет значение процесс иммунного воспаления или и
мунной агрессии, в сыворотке крови мож:
обнаружить аутоантитела к гладкой мусю
латуре, эритроцитам, иммуноглобулинам, митохондриям, антиядерные (антинуклеарные
антитела, антитела к ДНК, противоопухолевые антитела, криоглобулины и др.
Самым распространенным тестом обнаружения аутоантител в исследуемой сыворои
является метод иммунофлуоресценции, имеющий несколько модификаций. При прямо
иммунофлуоресценции к исследуемому препарату (например, срезам тканей), содержат!
му искомый антиген, добавляют антисыворотку с антителами к этому антигену. Предвар!
тельно антитела метят флуорохромом. В результате взаимодействия антигена и антитез
образуется иммунный комплекс, который фиксируется только в тех участках ткани, rj
имеется данный антиген. Эти участки легко обнаруживаются при микроскопии в ульт|
фиолетовом свете по характерному свечению - флуоресценции.
В клинической практике по понятным причинам чаще используют метод непрямой ш
мунофлуоресценции. На срезы тканей различных органов животных, содержащих извес
ные антигены, наносится исследуемая сыворотка (рис. 1.108, а). Если в ней содержат!
1.5. Иммунологические исследования
антитела (иммуноглобулины) к данному тканевому антигену, происходит реакция связывания этих антител антигеном (рис. 1.108, б). Не связавшиеся белки тщательно отмывают
и на срезы тканей наносят противочеловеческую IgG-антисыворотку, меченную флуорохромом (рис. 1.108, в). В результате антитела с флуорохромной меткой против человеческих иммуноглобулинов (например, против IgG), содержащиеся в антисыворотке (антитела к антителам-иммуноглобулинам класса G), связываются только с иммуноглобулина-
ми (антителами), которые присутствовали в исследуемой сыворотке больного и остались
фиксированными на соответствующих (известных) антигенах ткани. Люминесценция этих
фиксированных антител хорошо выявляется при микроскопии ткани в ультрафиолетовом
свете.
• Таким образом, на первом этапе непрямой иммунофлуоресценции происходит как бы
«закрепление» антител больного в тех местах ткани, где локализованы соответствующие
антигены (см. рис. 1.108, б), а на втором этапе - их обнаружение с помощью антител сыворотки к этим иммуноглобулинам, меченных флуорохромом (см. рис. 1.108, г).
• Метод иммунофлуоресценции используется для выявления аутоантител к гладкой муиулатуре, митохондриям, антиядерных, антинуклеарных и других антител. Для их обнаружения в сыворотке крови больного обычно используют срезы желудка и почки крыс.
Исследуемая 6
сыворотка
159
Антитела -1д
teem
ные антигены
Антитела
к IgG,
меченные
флуорохромом
Рис. 1.108. Схема метода непрямой иммунофлуоресценции.
«Ьнанесение исследуемой сыворотки на срезы тканей с известным антигеном; 6 - реакция связывания
«тлел антигеном; в - внесение стандартной антисыворотки, содержащей антитела к иммуноглобулинам
Фиксированные
антитела (1д)
Известные антигены
Флуорохром
Г
Соседние файлы в папке Библиотека им академика М.И. Перельмана