Вопрос 8. Этапы бактериологического исследования:

1. Забор материала:

а) выбор материала определяется клинической картиной:

- при заболеваниях верхних дыхательных путей – слизь из носа и зева,

мокрота, ликвор;

- при заболеваниях желудочно-кишечного тракта – испражнения,

промывные воды, рвотные массы;

- при генерализованных формах – кровь;

б) материал берут до начала лечения;

в) в разные стадии заболевания берут разный материал

2. Транспортировка:

а) необходимы специальные транспортные среды,

б) важно соблюдать условия транспортировки

3. Посев материала на плотные питательные среды для получения изолированных колоний

4. Изучение культуральных признаков

5. Изучение морфологических и тинкториальных(отношение к окраске)признаков= приготовление мазка и окраска по Граму

6. Выделение чистой культуры и накопление биомассы= посев на скошенный столбик элективной питательной среды

7. Проверка чистоты культуры= мазок, окраска по Граму

8. Идентификация выделенной чистой культуры= изучение биохимических и серологических свойств бактерий.

Вопрос 9. Методы выделения чистых культур аэробов:

1. Механическое разобщение клеток:

а) метод Коха: готовят десятикратные разведения материала в хлориде натрия, из каждого разведения 1 петлю вносят в пробирку с агаром (40⁰) и выливают его в чашку Петри;

б) метод Дригальского: 1 петлю материала наносят на поверхность агара в чашку Петри и растирают шпателем, затем, не прожигая его, растирают по поверхности агара второй, а затем третьей чашки и т.д;

в) механическое разобщение петлей;

г) количественный метод Голда: 1 мл жидкого или 1 г твердого материала вносят в 9 мл NaCl, затем 1 петлю материала наносят на чашку = делают 40 штрихов (сектор А), задевая штрихи сектора А, проводят 4 штриха (1-й сектор), аналогично засевают 2-й и 3-й секторы

2. Предварительная обработка материала с помощью физических или химических факторов.

Например: 1) неспорообразующие бактерии уничтожают прогреванием при 80 ⁰С 20 мин, споры при этом сохраняются;

2) для выделения микобактерий материал обрабатывают кислотой, при этом сопутствующая флора погибает

3. Избирательное подавление сопутствующих бактерий физическими или химическими факторами во время инкубации посевов.

Например: для выделений иерсиний чумы посевы инкубируют при Т=5 ⁰

4.Заражение чувствительных животных= для выделения возбудителя чумы из трупов грызунов

5. Использование биологических свойств бактерий. Например: метод Шукевича для выделения протея (ползучий рост).

Вопрос 10. Культивирование вирусов

Для культивирования вирусов используют:

- культуры клеток,

- куриные эмбрионы

- чувствительных лабораторных животных.

1. Культуры клеток = соматические или эмбриональные клетки человека или животных, культивируемые в лабораторных условиях.

Подразделяют:

А) по числу жизнеспособных генерацийна первичные, перевиваемые и полуперевиваемые.

Первичные культуры получают из тканей (эмбриональных или нормальных) многоклеточных организмов. Такие клетки не способны к делению – используются однократно.

В основе получения лежит обработка протеолитическими ферментами (трипсином) = первично-трипсинизированные. Н-р, эмбриональная ткань человека, почечная ткань эмбрионов человека и обезьян.

Перевиваемые культуры(стабильные) готовят из опухолевых клеток, способных длительно размножаться in vitro не меняя своих свойств.

Н-р,HeLa– выделены из карциномы шейки матки,

Hep-2 – из карциномы гортани,

Hep-3 – лимфокарцинома,

KB– эпидермоидная карцинома полости рта,

Детройт-6 – костный мозг больного раком легкого.

Преимущества перед первичными:

- продолжительность культивирования – десятки лет,

- высокая скорость размножения,

- меньшая трудоемкость,

- сохраняют свои свойства в замороженном состоянии много лет,

- возможность использования международных линий культур.

Но: злокачественный характер и возможность мутаций ограничивает применение для производства вакцин.

Полуперевиваемые культуры– диплоидные клетки различных тканей и органов, способные к ограниченному размножению in vitro. Они сохраняют свои свойства в течение 20-50 пассажей (пересевов) = до года. При культивировании не претерпевают злокачественного перерождения – преимущество перед перевиваемыми → могут использоваться в производстве вакцин.

Б) по технике приготовления – однослойные, суспензионные и органные.

Однослойные – способны прикрепляться и размножаться на поверхности стекла в видемонослоя →наибольшее применение в вирусологии

Суспензионные – размножаются во всем объеме питательной среды при постоянном ее перемешивании с помощью магнитной мешалки→ используются при промышленном приготовлении вакцин.

Органные – цельные кусочки органов и тканей, сохраняющие исходную структуру вне организма→применяются ограниченно.

Условия культивирования клеток:

1. Питательные среды сложного состава (среда 199, Игла), сод-т источники энергии (глюкозу), минеральные вещества, аминокислоты, витамины, сыворотку крови, факторы роста.

2. Клетки чувствительны к изменениям рН – для контроля рН добавляют индикатор и буферные растворы.

3. Соблюдение правил асептики

4. Использование лабораторной посуды из нейтрального стекла – пробирки, флаконы, матрасы (=флакон 4-х гранной формы)

5. Добавление антибиотиков к питательной среде для подавления роста бактерий

6. Соблюдение оптимальной температуры культивирования (36-38,5^о).

Обнаружение = индикация вирусов в культуре клеток

Индикацию вирусов проводят на основе следующих феноменов:

- цитопатогенного действия (ЦПД) вирусов или цитопатического эффекта,

- образования внутриклеточных включений,

- образования “бляшек”,

- реакции гемагглютинации, гемадсорбции или “цветной” реакции.

А) ЦПД - видимые под микроскопом морфологические изменения клеток (вплоть до их отторжения от стекла), возникающие в результате внутриклеточной репродукции вирусов

Культура клеток

ЦПД вируса

- округление и сморщивание клеток – пикорнавирусы,

- нарастающая деструкция – герпесвирусы,

- пролиферация (образование дырок) – поксвирусы,

-образование гигантских многоядерных клеток = симпласты – парамиксовирусы.

Б) Включения — скопление вирионов или отдельных их компонентов в цитоплазме или ядре клеток, выявляемые под микроскопом при специальном окрашивании.

Н-р, вирус натуральной оспы образует цитоплазматические включения - тельца Гварниери;

- вирус бешенства в цитоплазме образует тельца Бабеша-Негри,

- вирусы герпеса и аденовирусы - внутриядерные включения.

В) Бляшки, или “негативные” колонии — ограниченные участки разрушенных вирусами клеток, культивируемых на питательной среде под агаровым покрытием, видимые как светлые пятна на фоне окрашенных живых клеток. Один вирион образует потомство в виде одной бляшки. “Негативные” колонии разных вирусов отличаются по размеру, форме, поэтому метод бляшек используют для дифференциации вирусов, а также для определения их концентрации.

Г) Реакции:

Г1) Реакция немагглютинации (РГА) основана на способности некоторых вирусов вызывать агглютинацию (склеивание) эритроцитов за счет вирусных гликопротеиновых шипов – гемагглютининов.

Г2) Реакция гемадсорбции — способность культур клеток, инфицированных вирусами, адсорбировать на своей поверхности эритроциты.

Г3) Цветная” реакция оценивается по изменению цвета индикатора, находящегося в питательной среде культивирования. Если вирусы не размножаются в культуре клеток, то живые клетки в процессе метаболизма выделяют кислые продукты, что ведет к изменению рН среды и соответственно цвета индикатора. При продукции вирусов нормальный метаболизм клеток нарушается (клетки гибнут), и среда сохраняет свой первоначальный цвет.

 2. Куриные эмбрионы – 8-12-дневные – по сравнению с культурами клеток:

- реже бывают контаминированы вирусами и микоплазмами,

- обладают высокой жизнеспособностью и устойчивостью к неблагоприятным воздействиям,

Важен путь заражения:

При заражении материал вводят:

- в аллантоисную и амниотическую полости = ортомиксовирусы,

- на хорионаллантоисную оболочку = поксвирусы,

- желточный мешок = тогавирусы.

Важна температура культивирования:

- для миксовирусов – 33^о

- вируса натуральной оспы – 38,5

- вируса осповакцины - 40

Обнаружение вируса:

- на хорион-алантоисных оболочках – беловатые куполообразные бляшки – поксвирусы,

- задержка развития и гибель эмбриона – тогавирусы,

- накопление в эмбриональных жидкостях гемагглютининов – ортомиксовирусы.

3. Лабораторные животные (взрослые или новорожденные белые мыши, хомяки, кролики, обезьяны) –применяется для выделения тех вирусов, которые плохо репродуцируются в культуре клеток или курином эмбрионе,

- заражают: интраназально,

подкожно,

внутримышечно,

внутрибрюшинно,

интрацеребрально,

- обнаруживаютвирус по:

- развитию видимых клинических проявлений – параличи – рабдовирусы,

-патоморфологическим изменениям органов и тканей – пикорна-, тога-

- в реакции гемагглютинации с суспензией из органов,

- недостаток:

- высокая вероятность контаминации организма животных посторонними микробами,

- необходимость заражения культуры клеток для выделения чистой культуры вируса.