55. Методы изолирования, очистки и обнаружение алкалоидов.

1. Изолирование алкалоидов из биологического материала можно проводить общими методами для группы «нелетучих» ядов - подкисленным спиртом, водой, подкисленной щавелевой кислотой, либо частным методом - водой, подкисленной серной кислотой, по В. Ф. Крамаренко.

Для жидких алкалоидов, основания которых летучи с водяным паром, в качестве метода изолирования может быть применена перегонка с водяным паром. Для некоторых алкалоидов, например, для пахикарпина, разработан метод электродиализа.

Оптимальное значение рН для изолирования алкалоидов на:

1 стадии – при настаивании биологического материала с полярными растворителями (вода или этанол) - должно быть 2 -3, чтобы перевести алкалоиды в солеобразные ионизированные формы, хорошо растворимые в воде. При этом степень ионизации α~> 100%. Кислая реакция среды, кроме того, способствует разрушению комплексов алкалоидов с белками, что увеличивает выход алкалоидов.

На 2 стадии изолирования - при экстрагирования алкалоидов из жидкой фазы неполярным органическим растворителем - рН устанавливается в пределах 9- 10, что дает возможность перевести алкалоиды из солей в основания, те молекулярные формы, хорошо растворимые в органических растворителях. При этом α -> 0%

Оптимальным экстрагентом для большинства алкалоидов является хлороформ, для некоторых алкалоидов, например, морфина - изоамиловый спирт или дихлорэтан.

2. Очистка извлечений от балластных веществ.

Грубая очистка извлечений, содержащих алкалоиды, от балластных веществ, в частности белков, предусмотрена в некоторых методах изолирования. Так, в методе Стаса-Отто проводится осаждение белков абсолютным этанолом, а в методе В Ф Крамаренко - сульфатом аммония. Как правило, грубая очистка приводит к потерям алкалоидов за счет их со- осаждения с белками.

К более тонким методам очистки относятся:

1 - экстракционная очистка;

2 – хроматография;

3 – электродиализ;

1. Экстракционная очистка связана с экстракцией балластных веществ органическими растворителями из кислого водного раствора. При этом алкалоиды в виде солей остаются в водной фазе. Для выделения очищенных алкалоидов из водного раствора водную фазу подщелачивают гидроксидом аммония или натрия. При этом алкалоиды-соли переходят в алкалоиды-основания, которые экстрагируют органическим растворителем (хлороформом). Органическую фазу отделяют, растворитель испаряют, и остаток исследуют на наличие алкалоидов. При сильно загрязненных извлечениях очистку повторяют. Экстракционная очистка связана с частичными потерями алкалоидов за счет их перераспределения между водной и органической фазами. Такой вид очистки предусмотрен в методе В Ф Крамаренко где балластные вещества экстрагируются из кислой водной фазы эфиром.

2. Хроматографические методы очистки являются более экономичными по сравнению с экстракционными. Используются следующие разновидности метода:

• Адсорбционная колоночная хроматография применена Л М Власенко для выделения и очистки морфина

• Гель-хроматография - разновидность колоночной хроматографии (предложена В Ф Крамаренко )

• Хроматография в тонком слое сорбента (ХТС)

• Электрофорез - применен для выделения и очистки резерпина Л В Песаховичем

Наибольшего внимания из перечисленных методов очистки заслуживает ХТС благодаря своей доступности, простоте выполнения и высокой разрешающей способности.

3. Электродиализ применен Н И Вестфаль для очистки пахикарпина и стрихнина при выделении их из биологического материала. При этом в диализаторе создается электрическое поле, под действием которого ускоряется переход алкалоидов в водное извлечение через полупроницаемую мембрану, которая не пропускает крупные молекулы белков и продукты их распада, за счет чего и достигается очистка.

3. Идентификация выделенных алкалоидов.

С этой целью могут быть использованы как химические, так и физико-химические методы анализа.

План судебно-химического исследования на наличие алкалоидов включает следующие этапы:

а) Анализ начинают с общеалкалоидных осадительных реакций в качестве предварительных групповых проб;

б) Затем проводят ХТС-скрининг - также в качестве предварительного теста, но более специфичного благодаря индивидуальным величинам Rf для отдельных алкалоидов;

в) Далее выполняют частные реакции на отдельные алкалоиды - реакции окрашивания и микрокристаллические реакции;

г) Снимают спектральные характеристики алкалоидов в УФ и ИК-областях спектра;

д) Для некоторых алкалоидов проводят фармакологические пробы.