Программа «Геном человека».
В 1990 г. молекулярно – генетические лаборатории США, Западной Европы, России и Японии приступили к осуществлению Международной программы «Геном человека».
Программа включает три направления:
1) картирование генов человека и выяснения нуклеотидной последовательности человеческого генома;
2) структурно - функциональное изучение генома;
3) медицинскую генетику и генотерапию.
Для решения главной задачи этой программы – выяснения нуклеотидной последовательности человеческого генома - используют методы секвенирования ДНК. Это сложная методика, позволяющая расшифровать последовательность нуклеотидов ДНК. Предполагалось, что секвенирование всего генома будет осуществлено до 2005 года. Однако благодаря техническим усовершенствованиям этого процесса в настоящее время структура ДНК человека расшифрована практически полностью.
Кроме колоссального теоретического значения для фундаментальных наук, расшифровка строения ДНК человека важна для понимания патогенеза, предупреждения и лечения наследственных болезней, позволяет исследовать молекулярные механизмы моногенных заболеваний, способствует расшифровке генетических основ мультифакториальных заболеваний и наследственной предрасположенности к таким широко распространенным заболеваниям как атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, психические и онкологические заболевания..
Расшифровка строения генов, ответственных за наследственные заболевания, создает предпосылки для их диагностики и генотерапии.
Каталог генов и генных болезней в.Мак-Кьюсика.
Более 30 лет под руководством Виктора Мак-Кьюсика (проф. Университета Джона Хопкинса в Балтиморе) собирают информацию обо всех картированных генах человека и связанных с ними наследственных заболеваниях.
«Менделевское наследование у человека: каталог человеческих генов и генетических болезней» – так называется энциклопедия, которую издает Мак-Кьюсик каждые два года. Каждый локус имеет в каталоге шестизначный международный номер MYM). Первая цифра означает тип наследования:
–АД (аутосомно-доминантный)
–АР (аутосомно-рецессивный)
и 4 – гены сцепленные с Х и Y– хромосомами (сцепленный с полом тип наследования: ХР-сцепленный с Х-хромосомой рецессивный, ХД-сцепленный с Х-хромосомой доминантный).
5. –митохондриальные болезни.
В 1994 году (11 издание) в энциклопедии Мак-Кьюсика было описано 6678 картированных локусов, из них:
4458 генов АД
1730 – АР
412 – сцепленные с Х – хромосомой
19 – сцепленные с Y– хромосомой
59 – митохондриальной ДНК.
Для 2800 генов определена функция. Из них 770 локусов были связаны с моногенными заболеваниями, большинсктво генов клонированы. Клонирование гена позволяет получить большое количество его копий, что необходимо для диагностики и генотерапии.
Молекулярно-генетические методы. Использование в медицине.
Молекулярно-генетические методы (методы ДНК –диагностики) – это большая и разнообразная группа методов, предназначенная для выявления вариаций в структуре исследуемого участка ДНК. ДНК- методы используются в следующих направлениях:
Для диагностики моногенных и мультифакториальных наследственных болезней.
2. Для пренатальной диагностики моногенных болезней или пола плода (в случаях Х – сцепленного наследования).
3. В судебной медицине для идентификации личности (геномная дактилоскопия) и установления родства.
4. Для диагностики инфекционных заболеваний.
5. Для диагностики онкологических заболеваний.
Возможности диагностики связаны с осуществлением программы «Геном человека». Перечень моногенных болезней, диагностируемых молекулярными методами, и доступных пренатальной диагностике: муковисцидоз, мышечная дистрофия Дюшенна-Беккера, гемофилия (А и В), фенилкетонурия, болезнь Хантера (мукополисахаридоз), адрено – генитальный синдром , хорея Гентингтона, синдром фрагильной Х-хромосомы и др.
В 1993 году таких заболеваний было 130, в 1994 году – 600, сейчас еще больше. Сейчас возможна диагностика любого наследственного заболевания, ген которого картирован и доступен прямой или косвенной диагностике.
В перспективе будет возможно говорить о «генетическом паспорте новорожденных», то есть о том, что уже вскоре после рождений с помощью автоматизированной системы удастся проанализировать весь спектор наиболее распространенных заболеваний как моногенных, так и мультифакториальных.
Молекулярно-генетические методы можно разделить на прямые и косвенные.
Прямая диагностикапроводится в тех случаях, когда строение гена уже изучено. Она включает секвенирование ДНК, регистрацию изменения электрофоретической подвижности мутантных молекул ДНК, трансляцию белкового продуктаinvitroи др.Косвенное выявление мутаций применяется в тех случаях, когда строение гена не известно и вместе с тем имеется информация о других структурах, находящихся рядом с геном – определение полиморфизма длин рестрикционных фрагментов и др.
Рассмотрим некоторые из них.
Секвенирование ДНК - это наиболее точный метод,так как позволяет определить строение гена и выявить любую мутацию. Методики секвенирования весьма трудоемки, требуют значительных затрат материалов и времени, в связи с чем не нашли широкого применения в клинической генетике, а применяются главным образом для расшифровки генома человека.
С открытием в начале 70-х годов рестрикционных эндонуклеаз (рестриктаз) - ферментов, способных разрезать нити ДНК в строго определенных участках - сайтах рестрикции, исследователи получили возможность выделять более мелкие и в то же время стабильные по длине и легче идентифицируемые фрагменты. Определение полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) (RFLP – restriction fragments length polymorphism) один из распространенных методов ДНК-диагностики. Принцип метода: выделенная ДНК обрабатывается ферментами, которые «разрезают» ее на фрагменты в строго определенных участках (сайтах рестрикции). Патологические мутации могут изменять сайты рестрикции, что приводит к изменению длин полученных фрагментов.
Несколько позже широкое развитие получили различные способы изучения последовательностей ДНК с помощью олигонуклеотидных зондов - искусственно синтезированных коротких цепей нуклеотидов, меченных радиоактивными метками. При определенных условиях указанные зонды могут специфически связываться (гибридизоваться) с комплементарными последовательностями в анализируемой ДНК, свидетельствуя тем самым о присутствии искомого фрагмента.
Выделение ДНК для исследования указанными методами представляет собой достаточно трудоемкую процедуру. Во-первых, ДНК в клетках содержится в относительно небольших количествах по сравнению с другими веществами, поэтому для получения очищенных препаратов требуются сложные и дорогие методы. Во-вторых, молекулы ДНК, особенно эукариот, имеют значительную длину и представляют собой весьма хрупкую цепь, которая при различных биохимических манипуляциях оказывается так или иначе поврежденной.
Для выделения ДНК полученный биологический материал обрабатывают протеолитическими ферментами, чтобы удалить все белки. ДНК адсорбируют на пористых носителях или экстрагируют органическими растворителями, после чего следует многократное очищение. При этом получают всю ДНК клеток (геномную ДНК).
Исследователя обычно интересует только определенный, специфический участок ДНК, который трудно идентифицируется среди множества других, в том числе нетранскрибируемых ДНК-последовательностей.Эта задача решалась с помощью трудоемкого подхода - путем клонирования фрагментов ДНК (т.е.размножения) в различных организмах (т.н. векторах), чаще всего в фагах (вирусах бактерий) или во внехромосомных наследственных единицах - плазмидах. При этом интересующий фрагмент молекулы ДНК какого-либо организма вначале встраивался в геном фага либо в кольцевую ДНК плазмиды при помощи специальных ферментов - рестриктаз, нуклеаз, полимераз и лигаз, после чего происходило заражение бактерий фагом (трансдукция) или внесение плазмидной ДНК в цитоплазму микроорганизма (трансформация). Размножение бактерий тем самым вело к накоплению достаточно больших количеств интересующих исследователя фрагментов ДНК.
Однако процедуры молекулярного клонирования весьма трудоемки, требуют работы с радиоактивными веществами, высокой степени очистки ДНК, поэтому они практически не вышли за рамки крупных специализированных лабораторий, хотя необходимость исследования ДНК на уровне нуклеотидных последовательностей давно стала потребностью практического здравоохранения.
Указанные трудности были преодолены с открытием в 1983 г. К.Б.Мюллисом (США) метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), который нашел широкое применение в самых различных областях практической медицины.
Этапы ДНК-диагностики с использованием полимеразной цепной реакции
1. Получение материала для исследования. Для молекулярно-генетической диагностики используют любые ядросодержащие клетки.Для диагностики наследственного заболеваниячаще берут кровь (лейкоциты), реже смывы из полости рта, волосяные фолликулы.Для пренатальной диагностики проводятхориоцентез (получение ворсинчатой оболочки-хориона). плацентоцентез (получение ткани плаценты), амниоцентез (получение амниотической жидкости и выделение из нее клеток), кордоцентез (получение пуповинной крови).Для судебной медицины любые ткани (пятна крови, кожа, сперма и др.), для установления родства с помощью методов геномной дактилоскопии кровь. Для диагностики инфекционных заболеваний–соскобы из влагалища, уретры, бронхолегочные смывы, культуры возбудителей.Для диагностики онкологических заболеваний - красный костный мозг (при лейкозах) и др.
2. Выделение ДНК. Для исследования методом ПЦР пригодны даже небольшие фрагменты слабоочищенной ДНК. Как правило, ДНК из биологического материала при этом выделяют методами лизиса клеток с последующей очисткой от белковых компонентов.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет избирательно амплифицировать (многократно редуплицировать) интересующий исследователя участок ДНК в миллионы раз. Принцип ПЦР основан на амплификации ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы, осуществляющей синтез взаимно комплементарных цепей ДНК, начиная с двух олигонуклеотидных праймеров (затравок) -прямого и обратного. Праймеры – это фрагменты ДНК, комплементарные противоположным цепям ДНК в участках, ограничивающих выбранную область ДНК, и ориентированы 3'-концами навстречу друг другу в сторону той последовательности, которую необходимо амплифицировать. Таким образом, синтез новой цепи может идти только в одном направлении - начиная с 3'-конца в направлении встречного праймера. Во многом процесс амплификации сходен с редупликацией ДНК в ядре клетки. В реакционной смеси должны присутствовать:
1) матрица - исходная цепь изучаемой ДНК, по образцу которой и происходит синтез новых фрагментов,
2) нуклеотиды - "строительный материал" для наращивания вновь синтезируемых цепей ДНК,
3) фермент ДНК-полимераза, катализирующий процесс синтеза ДНК (в настоящее время используется термостабильная полимераза, выделенная из бактерий горячих источников с оптимумом работы при температуре 72 градуса) и
4) олигонуклеотидные праймеры.
Проведение реакции осуществляется в специальной буферной смеси с определенными концентрациями ионов калия, хлора и точным значением рН.
Смесь ставят в специальный прибор – амплификатор. В нем автоматически происходит смена температур, необходимых для реакции. В результате чего происходит многократная редупликация участка ДНК, который мы хотим выделить. В итоге число копий ДНК увеличивается в миллионы раз.
Полимеразная цепная реакция проходит циклически. Каждый цикл имеет три фазы:
1) Денатурация или плавление – смесь нагревают до 90 –95 градусов. При этом происходит разрыв водородных связей, соединяющих две цепи ДНК.
2) Отжиг – смесь охлаждают, праймеры соединяются с комплементарными участками ДНК.
3) Синтез – смесь вновь нагревают до 72 градусов, начинает работать термостабильная ДНК – полимераза и синтезируется дочерняя цепь ДНК. ДНК-полимераза достраивает нить нуклеотидов комплементарно матричной ДНК. При этом праймер включается в состав вновь синтезируемого участка нуклеиновой кислоты.
ДНК 1 фаза 2 фаза 3 фаза
праймер
С помощью ПЦР можно решать следующие задачи:
1) Амплификация желаемого участка ДНК, даже если анализируемый препарат недостаточно очищен или представляет собой сложную смесь молекул. Именно такими препаратами являются образцы крови, мочи, экссудатов, мокроты и других сред организма, а также бактериальные культуры.
Амплификация ДНК, присутствующей в образце в ничтожно малых количествах. По сути, в качестве стартового материала для ПЦР (как видно из схемы на рис.1) достаточно взять не только одну клетку, но и одну молекулу. Это важно при исследовании проб воздуха, воды и т.д. на наличие патогенных возбудителей заболеваний.
К настоящему времени разработано большое количество разновидностей ПЦР, среди которых практическое значение в ДНК –диагностике имеют:
1. Специфическая ПЦР с парой праймеров, применяемая для идентификации возбудителей заболеваний, диагностики наследственных болезней;
2. ПЦР-генотипирование с праймерами, выявляющими генетическую гетерогенность исследуемых организмов, применяемая в судебной медицине, в диагностике наследственных болезней.
Существуют специальные способы проведения ПЦР, позволяющие изучать не только ДНК, но и РНК. Это важно, например, при исследовании РНК-содержащих вирусов (ретровирусы, в том числе ВИЧ, вирус гепатита С, гриппа А и другие), а также при анализе экспрессии различных генов в организме. Подобные методики обычно включают в себя два этапа: обратную транскрипцию и ПЦР на матрице полученной ДНК.
4. Электрофорез фрагментов в ДНК в геле.В гель добавляют бромистый этидий (краска, которая окрашивает ДНК). Фрагменты ДНК перемещаются на определенное расстояние. Участок геля, в котором будут находиться фрагменты ДНК окрасится краской. Одновременно проводят электрофорез контрольных фрагментов.
5. Анализ полученных результатов.Участки геля, в которых находятся фрагменты ДНК, будут давать оранжевое свечение при ультрафиолетовом освещении Совпадение полос контрольного фрагмента и опытного позволят диагностировать наличие искомого гена. Гель можно сфотографировать или его изображение перенести на экран компьютера.
Идентификация возбудителей инфекционных заболеваний с помощью ПЦР.
Для выявления и идентификации возбудителя используется специфическая для каждого вида пара праймеров. При наличии ДНК возбудителя в исследуемой пробе происходит амплификация определенного фрагмента его ДНК, что впоследствии может быть выявлено методом электрофореза в агарозном или полиакрилкамидном геле.
В настоящее время эффективность и надежность ПЦР-диагностики заболеваний ни у кого не вызывает сомнений. Сегодня созданы и широко используются в практической диагностике тест-системы для идентификации:
-ВИЧ-инфекции (признан эталонным методом)
-гепатитов В, С, D,Eи т.д., в том числе количественная диагностика;
-заболеваний, передающихся половым путем: хламидиоз, уреаплазмоз, микоплазмоз, трихомоноз, гарднереллез, гонорея;
-TORCH-инфекций: токсоплазмоза, краснухи, герпеса. цитомегаловируса;
-туберкулеза и других бронхолегочных заболеваний, а также ряд других.
Ведется работа по внедрению ПЦР в диагностику дифтерии, желудочно-кишечных заболеваний. Практически при помощи этого метода может быть выявлен любой микроорганизм или вирус в любой среде.
Преимущества ПЦР:
1. Значительные (в 2-10 раз) сокращения затрат труда и времени.
2. Высокая точность, принципиальная невозможность получения ложноположительных результатов.
3. Возможность проведения исследования на крайне малом (несколько микролитров) объеме материала.
4. Простота подготовки материала к исследованию; может использоваться практически любая ткань или жидкость организма;
Проведение ПЦР-диагностики требует строгого соблюдать все санитарно-гигиенические нормы для избежания загрязнения образцов инородной ДНК, специально оборудованных лабораторий и обученного персонала.