Клиническая_лабораторная_диагностика_2019_А_А_Кишкун_2_е_изд_

Источник KingMed.info

дополнительную информацию, полезную в диагностическом и прогностическом плане при подозрении на эти инфекции, в особенности при беременности или планировании беременности.

Второе направление имеет своей целью установление родовой и видовой принадлежности микроба или вируса. В этом случае неизвестным компонентом реакции является антиген. Такое исследование требует постановки реакции с заведомо известными иммунными сыворотками.

Серологические исследования, выполняемые для обнаружения специфических антител и антигена возбудителя при инфекционных заболеваниях, - более доступные методы лабораторной диагностики, чем бактериологическое выявление возбудителя. В ряде случаев серологические исследования являются единственным методом диагностики инфекционных заболеваний, особенно вирусной природы.

Вместе с тем для диагностики инфекционных заболеваний почти всегда используется комплекс лабораторных методов. Для того чтобы практический врач лучше понимал место и значения каждого из методов, приводим основные подходы к диагностике инфекционных заболеваний, которые представлены на рис. 12.1.

При оценке результатов исследований следует иметь в виду, что положительный результат серологического исследования при одновременном культу-ральном выделении бактерий или вирусов, но при отсутствии клинической картины заболевания свидетельствует о бессимптомном инфекционном процессе. Отрицательный результат серологического исследования в этих же условиях позволяет рассматривать выделение микроорганизмов как кратковременное носительство. Поэтому динамика серологических реакций в комплексе с другими методами исследований оказывает наиболее существенную помощь в диагностике и определении прогноза течения инфекционного заболевания.

701

Источник KingMed.info

Рис. 12.1. Основные подходы к лабораторной диагностике инфекционных заболеваний (схема)

Серологические исследования не обладают 100%-ной чувствительностью и специфичностью в отношении диагностики инфекционных заболеваний, могут давать перекрестные реакции с антителами, направленными к антигенам других возбудителей. В связи с этим оценивать результаты серологических исследований необходимо с большой осторожностью и учетом клинической картины заболевания. Именно этим обусловлено использование для диагностики одной инфекции множества тестов, а также применение метода Western-blot для подтверждения результатов скрининговых методов. Данные о сравнительной аналитической чувствительности серологических методов приведены в табл. 12.1 (Кашкин К.П., Бехало В.А., 2004).

Таблица 12.1. Аналитическая чувствительность серологических методов

12.1. СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ

702

Источник KingMed.info

Серологические методы, используемые для диагностики инфекционных заболеваний, можно условно разделить на 4 большие группы.

К 1-й группе относятся прямые (непосредственные) методы определения реакции антигенантитело. Образующийся при этом комплекс антиген-антитело идентифицируется визуально либо с помощью простых оптических устройств. К таким методам относятся реакция преципитации в растворе, геле, на полимерной пленке, агглютинация бактериальных клеток, простейших, прямая реакция агглютинации эритроцитов антителами, вирусами.

Ко 2-й группе относятся реакции пассивной агглютинации, т.е. агглютинации частиц, с поверхностью которых связаны антигены или антитела. К этим методам относятся реакции непрямой (пассивной) геммагглютинации (РПГА), реакции связывания комплемента, латексагглютинации, коагглютинации, агглютинации частиц бентонита, желатиновых капсул, частиц сефарозы и др.

К3-й группе относятся индикаторные методы, основанные на использовании различного рода меток для выявления реакции антиген-антитело. Наиболее широкое распространение получили ИФА, иммунофлюоресцентный и радиоиммунологический анализ.

К4-й группе относятся молекулярно-генетические методы, которые включают метод ПЦР и метод гибридизации (метод генного зондирования).

В клинической практике для серологической диагностики инфекционных заболеваний используется комплекс методов, сущность которых должен понимать врач-клиницист. Реакция агглютинации широко применяется в лабораторной практике для серологической

диагностики бактериальных инфекций. Агглютинация представляет собой склеивание клеток или отдельных частичек - носителей антигена с помощью иммунной сыворотки к этому антигену. Она протекает в две фазы: первая фаза - соединение антигена с антителом; вторая - выпадение образовавшегося комплекса антиген + антитело (агглютината) в растворе солей. Наиболее часто реакцию агглютинации применяют для диагностики брюшного тифа и паратифов (реакция Видаля) и бруцеллеза (реакция Райта).

Реакция гемагглютинации бывает прямой и непрямой. В основе реакции прямой гемагглютинации лежит способность эритроцитов склеиваться при адсорбции на них определенных антигенов. Результат реакции регистрируют визуально (есть агглютинация эритроцитов или нет). Поскольку это происходит без участия антител, реакция не является серологической. Ее применяют в лаборатории для выбора рабочего разведения антигена, используемого в реакции торможения гемагглютинации.

РПГА наступает в том случае, когда к эритроцитам, сенсибилизированным антигеном, т.е. несущим на себе адсорбированный антиген, добавляют сыворотку больного, содержащую антитела, соответствующие антигену. В ней используют эритроциты или нейтральные синтетические материалы (например, частицы латекса), на поверхности которых сорбированы антигены (бактериальные, вирусные, тканевые) или антитела. Их агглютинация происходит при добавлении соответствующих сывороток или антигенов. Эритроциты, сенсибилизированные антигенами, называют антигенным эритроцитарным диагно-стикумом и используют для выявления и титрования антител. Эритроциты, сенсибилизированные антителами, называют иммуноглобулиновыми эритро-цитарными диагностикумами и применяют для выявления антигенов. Эта реакция часто превосходит по своей чувствительности и специфичности другие серологические методы. Реакцию пассивной гемагглютинации используют для диагностики заболеваний, вызванных бактериями (брюшной тиф и паратифы, дизентерия, бруцеллез, чума,

703

Источник KingMed.info

холера и др.), простейшими (малярия) и вирусами (грипп, аденовирусные инфекции, вирусный гепатит В, корь, клещевой энцефалит, крымская геморрагическая лихорадка и др.).

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) основана на феномене предотвращения

(торможении) иммунной сыворотки гемагглютинации эритроцитов вирусами, используется для выявления и титрования противовирусных антител. Она служит основным методом серодиагностики гриппа, кори, краснухи, эпидемического паротита, клещевого энцефалита и других вирусных инфекций, возбудители которых обладают гемагглютинирующими свойствами. Если в сыворотке крови больного есть антитела к определяемому вирусу, то антиген нейтрализуется и агглютинация эритроцитов не происходит (реакция положительная). При несоответствии антител антигену происходит агглютинация эритроцитов (реакция отрицательная).

Реакция преципитации относится к простым и ускоренным методам серологической диагностики бактериальных инфекций. В ней участвуют сыворотка больного и известный антиген. Постановки реакции преципитации осуществляется путем наслоения на исследуемую сыворотку больного разведенного антигена. Преципитация происходит в результате взаимодействия антител с растворимыми антигенами. Простейшим примером реакции преципитации является образование в пробирке непрозрачной полосы преципитации на границе наслоения антигена на антитело. Широко применяют различные разновидности реакции преципитации в полужидких гелях агара или агарозы (метод двойной иммунодиффузии по Оухтерлоню, метод радиальной иммунодиффузии, иммуноэлетрофорез), которые носят одновременно качественный и количественный характер. В результате свободной диффузии в геле антигенов и антител в зоне оптимального их соотношения образуются специфические комплексы - полосы преципитации, которые выявляют визуально или при окрашивании. Особенностью метода является то, что каждая пара антиген-антитело формирует индивидуальную полосу преципитации, и реакция не зависит от наличия в исследуемой системе других антигенов и антител.

Реакция нейтрализации основана на способности антител нейтрализовать некоторые специфические функции макромолекулярных или растворимых антигенов, например активность ферментов, токсины бактерий, болезнетворность вирусов. В бактериологии эту реакцию используют для обнаружения антистрептолизинов, антистрептокиназы и антистафилолизинов.

РСК применяют для обнаружения соответсвующих антител у больного при бактериальных и вирусных инфекциях. Эти реакции основаны на способности субкомпонента комплемента Clq и затем других компонентов комплемента присоединяться к иммунным комплексам. РСК относится к достаточно сложным серологическим реакциям, в которых, помимо антигена и антител, участвует еще гемолитическая система, позволяющая выявить результат исследования. Поэтому РСК протекает в две фазы: первая фаза - взаимодействие антигена и антитела с участием комплемента; вторая фаза - выявление степени связывания комплемента, что достигается добавлением гемолитической системы (эритроциты + гемолитическая сыворотка).

Если в исследуемой сыворотке содержатся антитела, гомологичные антигену, то образовавшийся комплекс антиген-антитело связывает комплемент; при добавлении гемолитической системы гемолиз эритроцитов в отсутствие комплемента не может произойти, эритроциты остаются неразрушенными (положительная РСК). При отсутствии в сыворотке антител, соответствующих антигену, соединение с антигеном не произойдет, комплемент останется свободным и может быть использован для гемолиза эритроцитов (отрицательная РСК).

704

Источник KingMed.info

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) заключается в использовании меченных флюорохромом антител, точнее, иммуноглобулиновой фракции антител lgG. Меченное флюорохромом антитело образует с антигеном комплекс антиген-антитело, который становится доступным наблюдению под микроскопом в ультрафиолетовых лучах, возбуждающих свечение флюорохрома. Реакцию прямой иммунофлюоресценции используют для изучения клеточных антигенов, выявления вируса в зараженных клетках и обнаружения бактерий и риккетсий в мазках. Так, для диагностики бешенства отпечатки кусочков мозга животных, подозреваемых на вирусоносительство, обрабатывают люминесцирующей антирабической сывороткой. При положительном результате в цитоплазме нервных клеток выявляют глыбки ярко-зеленого цвета. На обнаружении антигенов вирусов в клетках отпечатков со слизистой оболочки носа основана экспресс-диагностика гриппа, парагриппа и аденовирусной инфекции.

Более широко применяют метод непрямой иммунофлюоресценции, основанный на выявлении комплекса антиген-антитело с помощью люминесцирующей иммунной сыворотки против IgGантител и используемой для обнаружения не только антигенов, но и титрования антител. Метод нашел применение в серодиагностике герпеса, цитомегаловирусной инфекции, лихорадки Ласса. Препараты с наслоенной исследуемой сывороткой крови помещают в термостат при температуре 37 °С для образования иммунных комплексов, а затем после отмывания несвязавшихся реагентов выявляют эти комплексы меченой люминесцирующей сывороткой против иммуноглобулинов человека. Применяя меченые иммунные сыворотки против IgMили IgG-антител, можно дифференцировать тип антител и обнаруживать ранний иммунный ответ по наличию IgM-антител.

ИФА в последние годы наиболее широко используется в практике лабораторий для серологической диагностики вирусных, бактериальных, грибковых и других инфекций. Он основывается на двух принципиальных научных открытиях. Первое заключается в способности энзимов и антител, ковалентно или нековалентно связанных с твердой основой, сохранять свою функциональную активность, т.е. расщеплять субстрат (ферменты) и связывать антигены/ антитела; второе базируется на создании комплекса антитело-фермент (Аb-F) в виде конъюгата, сохраняющего свою биологическую активность в растворе. Комплекс Аb-F-конъюгаты характеризуются высочайшей специфичностью и чувствительностью, достигающей 97-99%. Существует несколько модификаций ИФА:

-ELISA (enzyme linked immunoadsorbent assay) - гетерогенный ИФА;

-EIA (enzyme immunoassay) - твердофазный ИФА;

-EMIT (enzyme multiplied immunoassay technique) - гомогенный ИФА (используется в основном для выявления только гормонов, пептидов, лекарственных и наркотических веществ).

Рассмотрим принцип определения специфических антител методом твердофазного ИФА. На рис. 12.2 показана общая схема метода, состоящего из трех стадий, соединенных на рисунке знаком плюс. Во время каждой стадии в систему добавляется очередной компонент, инкубируется некоторое время, необходимое для образования иммунного комплекса. Затем ячейка промывается для удаления не связавшихся компонентов. После этого переходят к следующей стадии реакции, которая обозначена следующим знаком плюс на схеме.

705

Источник KingMed.info

Рис. 12.2. Определение антител методом твердофазного иммуноферментного анализа (а, б, в)

Более детально процесс образования иммунного комплекса представлен на рис. 12.2, а. На твердой поверхности пластиковой лунки, изображенной на рисунке слева, сорбирован антиген (Ag) любого инфекционного агента (фрагмент вируса, бактерии, простейшего и т.п.). В эту лунку вносится исследуемый биологический материал - сыворотка крови больного. Если в ней содержатся антитела к инфекционному агенту (на рисунке обведены), то они закрепляются на соответствующих антигенах (Ag) и остаются связанными при промывке. На этом первая стадия заканчивается. Это основная «специфическая» стадия процесса. Последующие стадии нужны лишь для выявления образовавшегося иммунного комплекса.

На второй стадии анализа в лунку вносят антитела с заранее прикрепленным к ним ферментом, способные связаться с антителами сыворотки крови обследуемого пациента, закрепившимися на инфекционном агенте. Это так называемый конъюгат. Если в ячейке имеются образовавшиеся на первой стадии процесса иммунные комплексы, то возникает «молекулярная цепочка», на конце которой находится фермент. На следующей стадии в лунку добавляется раствор бесцветного вещества - хромогена. Это вещество приобретает окраску после расщепления его присутствующим в ячейке ферментом. Методы ИФА основаны на использовании антител, конъюгированных с ферментами, главным образом пероксидазой хрена (дает желтокоричневую окраску раствора) или щелочной фосфатазой (дает желто-зеленую окраску раствора). Если все антитела сыворотки крови больного взаимодействуют с заведомо известным антигеном, в лунке образуется окрашенный комплекс (рис. 12.2, б). Если на первой стадии анализа иммунных комплексов не образовалось (рис. 12.2, в), то отсутствует и вся последующая часть реакции, вследствие чего хромоген не окрашивает раствор.

Для обнаружения самих инфекционных агентов, а точнее, их антигенов (Ag), применяется другая модификация метода твердофазного ИФА, которая представлена на рис. 12.3. В этом случае на поверхности планшета (твердой фазе) сорбируются заведомо известные специфические антитела. К ним добавляется сыворотка крови или другой биологический материал, содержащий неизвестный антиген (рис. 12.3а). В случае соответствия антител антигену образуется комплекс антитело-антиген, к которому, как и в предыдущем случае, добавляется комплекс антителофермент. Если в исследуемой сыворотке присутствует искомый антиген, то образуется иммунный комплекс. В ячейке присутствует фермент, который способен расщеплять хромоген с образованием окрашенного продукта (рис. 12.3б), - реакция положительная. Если в исследуемом

706

Источник KingMed.info

образце искомый антиген отсутствует, то окрашивания не происходит (рис. 12.3в) - реакция отрицательная.

Рис. 12.3. Определение антигенов методом твердофазного иммуноферментного анализа (а, б, в)

Используют также ферменты, разлагающие не только хромогенный, но и люмогенный субстрат. В этом случае при положительной реакции появляется свечение.

Молекулярно-генетические методы все более широко используются в клинической практике для диагностики инфекционных заболеваний. Метод ПЦР будет рассмотрен более детально в специальном разделе этой главы. Метод гибридизации (метод генного зондирования) во многом является конкурентом метода ПЦР, поэтому требует понимания его основ.

В основе метода генного зондирования лежит способность нуклеиновых кислот к гибридизации - образованию двухцепочных структур за счет взаимодействия комплементарных нуклеотидов (А- Т, Г-Ц). Для определения искомой последовательности ДНК (или РНК) специально создается так называемый зонд полинуклеотид с определенной последовательностью оснований. В его состав вводят специальную метку, позволяющую идентифицировать образование комплекса. Схема реакции представлена на рис. 12.4.

Рис. 12.4. Схема реакции генного зондирования для обнаружения в образцах ДНК или РНК микроорганизмов специфическим меченым зондом

Для проведения анализа ДНК пробу подвергают денатурации с целью получения одноцепочных структур, с которыми и реагируют молекулы ДНКили РНК-зонда. Для приготовления зондов используют либо различные участки ДНК (или РНК), выделенные из естественного источника (например, того или иного микроорганизма), как правило, представленные в виде генетических

707

Источник KingMed.info

последовательностей в составе векторных плазмид, либо химически синтезированные олигонуклеотиды. В некоторых случаях в качестве зонда применяют препараты геномной ДНК, гидролизованной на фрагменты, иногда - препараты РНК, особенно часто - рибосомальная РНК.

В качестве метки используют различные индикаторы: радиоактивные изотопы, флюоресцеины, биотоп (с дальнейшим проявлением комплексом ави-дин-фермент) и т.п.

Проведение анализа можно разделить на следующие стадии: подготовка образцов (в том числе экстракция и денатурация ДНК), фиксация пробы на носителе (чаще всего - полимерный мембранный фильтр), предгибридизация, собственно гибридизация, отмывание несвязавшихся продуктов, детекция.

Для исследования используют пробы сыворотки крови, мочи, уретральных соскобов, форменных элементов крови или цельной крови на присутствие инфекционного агента. Для освобождения нуклеиновых кислот из состава клеточных структур проводят лизис клеток, а в некоторых случаях очищают препарат ДНК с помощью фенола. Денатурация ДНК, т.е. переход ее в одноцепочечную форму, происходит при обработке щелочью. Затем образец нуклеиновых

кислот фиксируют на носителе - нитроцеллюлезной или нейлоновой мембране, обычно путем инкубации от 10 мин до 4 ч при 80 °С в вакууме. Далее в процессе предгибридизации достигается инактивация свободных мест связывания для уменьшения неспецифического взаимодействия зонда с мембраной. Процесс гибридизации занимает от 2 до 20 ч в зависимости от концентрации ДНК в образце, концентрации используемого зонда и его размера.

После окончания гибридизации и отмывания несвязавшихся продуктов проводится детекция образовавшегося комплекса. Если в состав зонда входит радиоактивная метка, то для проявления реакции мембрану экспонируют с фотопленкой (ауторадиография). Для других меток используют соответствующие процедуры. Например, метод определения модифицированных участков ДНК с помощью антител или введеных в состав зонда низкомолекулярных компонентов (биотин, дигоксин и т.п.) с последующим проявлением конъюга-том авидин-фермент, антитело-фермент, как в методе ИФА.

Возможности использования различных лабораторных методов для диагностики инфекционных заболеваний приведены в табл. 12.2.

Таблица 12.2. Возможности использования различных лабораторных методов для диагностики инфекционных заболеваний

Источник KingMed.info

12.2. СИФИЛИС

Сифилис - передающееся половым путем заболевание, которое вызывает бледная спирохета (Treponema pallidum). Заболевание начинается с появления безболезненной язвы в

месте внедрения возбудителя (твердого шанкра) и регионарного лимфаденита. Через некоторое время инфекция становится генерализованной: развивается вторичный, а затем третичный сифилис. Классификация сифилиса приведена ниже.

•Первичный - развивается спустя 10-90 сут (в среднем 21 сут) после заражения.

•Вторичный - развивается спустя 2-6 мес после заражения или 2-10 нед после появления твердого шанкра.

•Латентный (скрытый) - стадия болезни, при которой серологические реакции положительны, а какие-либо признаки поражения кожи, слизистых и внутренних органов отсутствуют:

-ранний латентный - менее 2 лет с начала заболевания;

-поздний латентный - более 2 лет с начала заболевания;

-неуточненный латентный.

•Третичный - развивается через 3-7 лет после начала заболевания (от 2 до 60 лет), гуммы появляются через 15 лет.

•Врожденный.

Патогенез сифилиса представлен на рис. 12.5.

Для диагностики сифилиса наиболее широко используются серологические методы, позволяющие обнаруживать иммунные сдвиги (появление противосифилитических антител) в организме больного в ответ на размножение в нем возбудителя болезни. Характер выявляемых у больных противосифилитических антител обусловлен особенностями антигенного строения бледной трепонемы.

Наиболее изучены следующие антигены:

- протеиновые антигены бледной трепонемы; имеющие в своем составе фракцию, общую для патогенных трепонем и сапрофитных трепонем, против которой синтезируются групповые антитела; кроме того, имеется фракция, специфичная только для патогенных трепонем; протеиновые антигены бледной трепонемы высокоиммуногенны, антитела против них появляются в организме больного в конце инкубационного периода или в течение первой недели после появления твердого шанкра;

709

Источник KingMed.info

-антигены полисахаридной природы (они мало иммуногенны, так как антитела против них не достигают значительных титров; роль этих антител в серодиагностике сифилиса незначительна);

-липидные антигены, антитела к которым в организме больного появляются примерно на 5-6-й неделе после заражения.

Рис. 12.5. Патогенез сифилиса (схема)

Возникновение противосифилитических антител при заболевании происходит в соответствии с общими закономерностями иммунного ответа: вначале вырабатываются антитела класса IgМ, по мере развития болезни начинает преобладать синтез IgG. Антитела IgМ появляются на 2-4-й нед после заражения и исчезают у нелеченных больных примерно через 18 мес; при лечении раннего сифилиса - через 3-6 мес; позднего - через 1 год. Антитела IgG появляются обычно на 4- й нед после заражения и достигают более высоких титров, чем IgМ. Они могут длительно сохраняться даже после клинического излечения больного (рис. 12.6).

710