Клиническая_лабораторная_диагностика_2019_А_А_Кишкун_2_е_изд_

Источник KingMed.info

клинической картины заболевания, что затрудняет диагностику. Обнаружение вируса гепатита С в крови с использованием ПЦР - более информативный метод диагностики. Выявление ПЦР РНК вируса гепатита С свидетельствует о виремии, позволяет судить о репликации вируса в организме и является одним из критериев эффективности противовирусной терапии. Обнаружение РНК вируса гепатита С с помощью ПЦР на ранних этапах развития вирусной инфекции на фоне полного отсутствия каких-либо серологических маркеров может служить самым ранним свидетельством инфицирования. Однако изолированное выявление РНК вируса гепатита С на фоне полного отсутствия каких-либо других серологических маркеров не может полностью исключить ложноположительный результат ПЦР. В таких случаях требуются всесторонняя оценка клинических, биохимических и морфологических исследований и повторное неоднократное подтверждение наличия инфекции ПЦР.

Важное значение имеет применение метода ПЦР у больных с хроническим ВГ-С, так как у большинства из них отсутствует корреляция между наличием вирусной репликации и активностью печеночных ферментов. В таких случаях только ПЦР позволяет судить о наличии вирусной репликации, особенно если конечный результат выражается количественно. В большинстве случаев заболевания исчезновение из сыворотки крови РНК вируса гепатита С наблюдается позже нормализации печеночных ферментов, поэтому их нормализация не может служить основанием для прекращения противовирусного лечения. Алгоритм диагностики ВГ-С с использованием метода ПЦР приведен на рис. 12.26.

Практически важно для выявления РНК вируса исследовать методом ПЦР не только сыворотку крови, но и лимфоциты, гепатобиоптаты. Вирусы удается обнаружить в 2-3 раза чаще в ткани печени, чем в сыворотке крови. При оценке результатов исследования сыворотки крови на РНК вируса гепатита С следует помнить, что виремия может носить флюктуирующий характер (как и изменение активности ферментов). Поэтому после положительных результатов исследования ПЦР можно получить отрицательный результат и наоборот. В таких случаях для разрешения возникающих сомнений лучше исследовать гепа-тобиоптаты.

771

Источник KingMed.info

Рис. 12.26. Алгоритм диагностики вирусного гепатита C (схема)

Обнаружение РНК вируса гепатита С в материале с помощью ПЦР используется в целях:

-разрешения сомнительных результатов серологических исследований;

-дифференциальной диагностики гепатита С от других форм гепатита;

-выявления острой стадии заболевания по сравнению с перенесенной инфекцией или контактом; определения стадии инфицированности новорожденных от серопозитивных по вирусу гепатита С матерей;

-контроля эффективности противовирусного лечения.

Все вышеизложенные особенности оценки результатов и подходов к диагностике вируса гепатита С с использованием ПЦР относятся и к другим инфекциям.

Метод ПЦР позволяет не только выявить РНК ВГ-С в исследуемом материале, но и установить его генотип. При инфицировании пациента субтипом 1b хронический вирусный гепатит С развивается примерно в 90% случаев, при наличии субтипов 2a и За - в 33-50%. У пациентов с субтипом 1b заболевание протекает в более тяжелой форме и часто заканчивается развитием цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы.

Определение генотипа вируса имеет важное значение не только для подбора пациентов с хроническим ВГ-С к проведению лечения противовирусными препаратами, но и определения продолжительности терапии. Чтобы добиться максимальной частоты устойчивого

772

Источник KingMed.info

вирусологического ответа у больных с генотипом 1 ВГ-С, необходимо проводить полный 48недельный курс лечения. Пациенты с генотипами 2 и 3 ВГ-С более чувствительны к лечению, поэтому элиминации вирусов можно добиться с помощью 24-недельного курса терапии.

Показаниями к противовирусному лечению хронического вирусного гепатита С интерферономальфа являются:

-повышение уровня трансаминаз;

-наличие РНК ВГ-С в крови;

-генотип 1 ВГ-С;

-высокий уровень виремии в крови (>8,0×105 копий/мл);

-гистологические изменения в печени: фиброз, умеренные или выраженные воспалительные явления.

Для оценки эффективности лечения хронического вирусного гепатита С интерфероном-α Европейской группой по изучению печени рекомендуются определенные критерии.

• Биохимические:

-первичная ремиссия - два последовательных нормальных значения АЛТ, взятых в процессе лечения с интервалом не менее 2 нед;

-прекращение ремиссии (ускользание) - повторное повышение АЛТ еще в ходе лечения;

-стабильная ремиссия - стойкая нормализация АЛТ в течение первых 6 мес наблюдения после окончания лечения;

-длительная ремиссия - стойкая нормализация АЛТ на протяжении не менее 24 мес после окончания лечения;

-отсутствие ремиссии - любая другая динамика АЛТ к концу лечения;

-рецидив - повторное повышение АЛТ в ходе лечения или в ближайшие 6 мес после окончания терапии.

•Вирусологические - определение РНК ВГ-С должно проводиться до лечения и к концу терапии, а затем через 6 и 24 мес наблюдения. Результаты оценивают аналогично биохимическим. При количественном определении РНК ВГ-С эффективность лечения оценивают по уровню снижения виремии.

•Гистологические (не всегда считаются обязательными). Для оценки используют индекс гистологической активности в баллах. Выделяют ремиссию, неполную ремиссию (уменьшение активности не менее чем на 2 балла), отсутствие ремиссии. В настоящее время общепринятым критерием ответа на противовирусную терапию служит элиминация РНК ВГ-С - невозможность ее определения через 24 нед после завершения лечения. Устойчивый вирусологический ответ - оптимальный критерий эффективности лечения, который ассоциируется с улучшением гистологической картины и качества жизни и снижением частоты прогрессирования фиброза и развития цирроза и смертности у пациентов с далеко зашедшими стадиями болезни. В связи с появлением чувствительных и специфичных методов анализа РНК ВГ-С биохимические критерии ответа на терапию все реже используются в клинической практике.

12.13.2. Обнаружение вируса гепатита В

773

Источник KingMed.info

Примерно 5-10% случаев цирроза и других хронических заболеваний печени обусловлены хроническим носительством вируса гепатита В. Маркерами активности таких заболеваний являются HBeAg и ДНК вируса гепатита В в сыворотке крови.

ПЦР позволяет определять в исследуемом материале (кровь, пунктат печени) ДНК вируса гепатита В как качественно, так и количественно. Качественное определение вируса гепатита В в материале позволяет подтвердить наличие вируса в организме больного и тем самым устанавливает патогенез заболевания. Количественный метод определения содержания ДНК вируса гепатита В в исследуемом материале дает важную информацию об интенсивности развития заболевания, эффективности лечения и развитии резистентности к антивирусным препаратам. Для диагностики вирусного гепатита методом ПЦР в сыворотке крови в настоящее время применяются тест-системы, чувствительность которых составляет 50-100 копий в пробе, что позволяет детектировать вирус при его концентрации 5×103-104 копий/мл. ПЦР при вирусном гепатите В, безусловно, необходима для суждения о вирусной репликации. Вирусную ДНК в сыворотке крови обнаруживают у 50% больных при отсутствии HBeAg. Материалом для выявления ДНК вируса гепатита В может служить сыворотка крови, лимфоциты, гепатобиоптаты. Оценка результатов исследования на ДНК вирусного гепатита В во многом аналогична описанному для гепатита С.

Обнаружение ДНК вируса гепатита В в материале с помощью ПЦР необходимо для:

- разрешения сомнительных результатов серологических исследований; - выявления острой стадии заболевания по сравнению с перенесенной

инфекцией или контактом; - контроля эффективности противовирусного лечения. Существует зависимость между исходом острого вирусного гепатита В и концентрацией ДНК вируса гепатита В в крови больного. При низком уровне

виремии (менее 0,5 пг/мкл) процесс хронизации инфекции близок к нулю, при концентрации ДНК от 0,5 до 2 пг/мл хронизация процесса наблюдается у 2530% больных, а при высоком уровне виремии (более 2 пг/мл) острый вирусный гепатит В чаще всего переходит в хронический.

12.13.3. Обнаружение вируса иммунодефицита человека

Метод ПЦР для обнаружения РНК ВИЧ может быть качественным и количественным. Качественное обнаружение РНК ВИЧ с помощью ПЦР используют для:

-неонатального скрининга;

-подтверждения результатов скринингового серологического исследования;

-скрининга пациентов с высоким риском;

-разрешения сомнительных результатов по иммуноблоттинговому исследованию;

-контроля эффективности противовирусного лечения;

-определения стадии заболевания СПИД (переход инфицированности в заболевание).

Прямое количественное определение РНК ВИЧ с помощью ПЦР позволяет более точно, чем определение содержания CD4+-клеток, предсказать скорость развития СПИДа у лиц, инфицированных ВИЧ, следовательно, более точно оценить их выживаемость. Высокое содержание вирусных частиц обычно коррелирует с выраженным нарушением иммунного статуса и низким содержанием CD4+-клеток. Низкое содержание вирусныхчастиц обычно

774

Источник KingMed.info

коррелирует с более благополучным иммунным статусом и более высоким содержанием CD4+- клеток. Содержание вирусной РНК в крови позволяет предсказать переход заболевания в клиническую стадию. При содержании РНК-1 ВИЧ >74 100 копий/мл почти у всех пациентов развивается клиническая картина СПИДа. Вероятность развития СПИДа в 10,8 раза больше у лиц с содержанием ВИЧ-1 в крови >10 000 копий/мл, чем у лиц с содержанием ВИЧ-1 в крови <10 000 копий/мл. При инфекции ВИЧ прогноз непосредственно определяется уровнем виремии. Снижение уровня виремии при лечении улучшает прогноз заболевания. Прогностическое значение показателя виремии в отношении развития СПИДа и смерти пациентов с ВИЧ представлено в табл. 12.11.

Таблица 12.11. Прогностическое значение показателя виремии в отношении развития синдрома приобетенного иммунодефицита человека и смерти пациентов с вирусом иммунодефицита человека

Экспертами разработаны показания для терапии пациентов с ВИЧ. Лечение показано пациентам с количеством CD4+-клеток в крови менее 300 в 1 мкл или уровнем РНК ВИЧ в сыворотке выше 20 000 копий/мл (ПЦР). Оценка результатов антиретровирусной терапии лиц, инфицированных ВИЧ, проводится по снижению уровня сывороточной РНК ВИЧ. При эффективном лечении уровень виремии должен снижаться в 10 раз в течение первых 8 нед и быть ниже предела чувствительности метода (ПЦР) (<500 копий/мл) через 4-6 мес после начала терапии.

12.13.4. Обнаружение цитомегаловируса

Обнаружение частиц вируса в крови больного с помощью ПЦР используют для диагностики цитомегаловирусной инфекции и контроля эффективности противовирусного лечения. В отличие от серологических методов диагностики цитомегаловирусной инфекции, где выявляют антитела к ЦМВ, ПЦР позволяет выявить наличие непосредственно ЦМВ и количественно выразить его концентрацию в сыворотке крови. Выявление ЦМВ имеет большое значение в диагностике перинатальной патологии. Внутриутробная и перинатальная передача ЦМВ может иметь тяжелые последствия. Цитомегаловирусная инфекция во время беременности часто протекает в субклинической форме и сопровождается относительно невыраженными симптомами. ПЦР в таких случаях позволяет выявить этиологический фактор заболевания. Материалом для исследования могут служить клетки осадка мочи (новорожденных детей), эпителий цервикального канала больных женщин, околоплодные воды, соскобы с конъюнктивы глаз и урогенитального тракта, слюна, пунктаты печени.

12.13.5. Обнаружение вируса папилломы человека

Вирусы папилломы человека являются малыми ДНК-содержащими онкогенными вирусами, которые инфицируют эпителиальные клетки и индуцируют пролиферативные поражения. В настоящее время выделено более 70 типов вируса папилломы человека. Эпидемиологический

775

Источник KingMed.info

анализ данных исследований на наличие вируса папилломы человека позволил выдвинуть концепцию об участии вирусов этой группы в развитии эпителиальных злокачественных новообразований. Типы вируса папилломы человека, выявляемые при различных поражениях кожи и слизистых оболочек, приведены в табл. 12.12.

Более 90% всех цервикальных карцином являются позитивными на присутствие вирусов папилломы человека. Наиболее часто в материале из опухолей шейки матки обнаруживают 16 и 18-й типы вирусов.

Вирусы папилломы человека типа 6 и 11 признаны этиологическим началом рецидивирующего респираторного папилломатоза, который обычно поражает носоглотку, трахею, гортань, может прогрессировать и стать распространенным бронхопульмональным заболеванием. В большинстве случаев папил-ломатоз является доброкачественным, однако может трансформироваться в плоскоклеточную карциному.

Таблица 12.12. Типы вируса папилломы человека, выявляемые при различных поражениях кожи и слизистых оболочек

ДНК вируса папилломы человека 16-го типа часто выявляют в клетках уротели-альной карциномы при раке мочевого пузыря у пациентов с иммунодефицитом.

Единственным методом обнаружения вирусов папилломы человека при перечисленных заболеваниях является метод ПЦР. Материалом для исследования служат пунктаты опухолей, лимфатических узлов, отделяемое из влагалища, носа, трахеи, моча. Обнаружение в исследуемом материале вируса папилломы человека определенного типа еще не говорит о наличии у пациента злокачественной опухоли, но требует проведения гистологического исследования субстрата болезни и последующего динамического наблюдения за ним. Те женщины, у которых длительно персистирует вирус папилломы человека в шейке матки, по сравнению с теми, у которых нет этого вируса, имеют примерно в 65 раз более высокий риск развития рака шейки матки. Риск еще выше (130-кратный) у женщин старше 30 лет, если они инфицированы типами 16 или 18 вируса папилломы человека.

Высказывается мнение о важной роли обнаружения вирусов папилломы человека в биоптатах лимфатических узлов при цервикальной карциноме для определения объема оперативного лечения и выявления интактных и пораженных метастазами лимфатических узлов. При нахождении вирусов папилломы человека в лимфоузлах, даже при отсутствии гистологических

776

Источник KingMed.info

признаков их опухолевого поражения, результаты исследования необходимо расценивать как наличие метастазов в лимфатические узлы.

По результатам исследований на вирус папилломы человека методом ПЦР, проведенным до и после лечения, можно оценивать его эффективность.

12.13.6. Обнаружение микоплазм

Микоплазмы относятся к условно-патогенным микроорганизмам. Они персистируют и паразитируют на мембранах эпителиальных клеток и могут локализоваться как экстра-, так и интрацеллюлярно. Известно около 11 видов микоплазм, для которых человек является естественным хозяином. Из них клиническое значение имеют M. hominis, M. pneumoniae, M. genitalium, M. fermentas, U. urealyticum. Колонизируя слизистые поверхности, они вызывают хронические воспалительные процессы урогенитального и респираторного трактов, являются этиологическим фактором ревматоидного артрита и вызывают септический артрит. В последние годы появились сообщения о роли микоплазм в развитии таких заболеваний, как острый гломеруло- и пиелонефрит. При негонококковом уретрите микоплазмы выделяют методом ПЦР у 37-43% обследованных, при гломерулонефрите - у 47%, при пиелонефрите - у 18%, склерозе предстательной железы - у 41%, при сальпингитах и цервицитах - у 50%, при послеродовом сепсисе - у 50% больных.

Метод ПЦР выявляет непосредственно ДНК микоплазм в исследуемом материале. Для обнаружения микоплазм при заболеваниях легочной системы лучшим материалом для ПЦР является бронхиальный лаваж. При заболеваниях мочевыводящего тракта исследуют мочу, отделяемое из уретры, влагалища, цервикального канала, сок предстательной железы. Наиболее часто при урогенитальных инфекциях обнаруживается U. urealyticum - в 20-50% случаев, M. hominis - в 10-25%.

12.13.7. Обнаружение Chlamidia trachomatis

Диагностика хламидиоза с помощью ПЦР - наиболее чувствительный и специфичный метод из всех, которые используют в лабораториях в настоящее время. Чувствительность метода составляет 95-97%, а специфичность - 9598%. Обнаружение Chlamidia trachomatis в материале из уретры с помощью ПЦР используется для:

-скрининга в популяции с высоким риском;

-обнаружения Chlamidia trachomatis в моче;

-разрешения сомнительных результатов других методов исследования;

-контроля эффективности проводимого лечения.

При урогенитальных инфекциях Chlamidia trachomatis в материале из уретры методом ПЦР обнаруживают в 15-40% случаев. При ревматоидном артрите урогенитальную инфекцию выявляют у 84% больных. Из них хламидиоз установлен у 28% больных, M. hominis - у 13%, U. urealyticum - у 10%. Хламидии можно обнаружить у больных с ревматоидным артритом не только в отделяемом из урогенитального тракта, но и в жидкости из суставов.

В настоящее время убедительно показана роль Chlamidia trachomatis в генезе хронического простатита. Наибольший интерес в этом плане представляют случаи абактериального хронического простатита. Материалом для исследования могут служить секрет предстательной железы, полученный после ее массажа, эякулят, биопсийный материал.

777

Источник KingMed.info

Сравнительная оценка различных методов диагностики хламидийной инфекции представлена в табл. 12.13.

Таблица 12.13. Сравнительная оценка различных методов диагностики хламидийной инфекции

778

Источник KingMed.info

Глава 13. Бактериологические и паразитологические исследования

Бактериологические исследования в клинической практике наиболее часто проводят при подозрении на гнойно-воспалительные заболевания с целью их диагностики, изучения этиологической структуры, определения чувствительности возбудителей к антибактериальным препаратам. Результаты бактериологических анализов способствуют выбору наиболее эффективного препарата для антибактериальной терапии, своевременному проведению мероприятий для профилактики внутрибольничных инфекций.

Возбудителями гнойно-воспалительных заболеваний являются истинно-патогенные бактерии, но наиболее часто условно-патогенные микроорганизмы, входящие в состав естественной микрофлоры человека или попадающие в организм извне. Истинно-патогенные бактерии в большинстве случаев способствуют развитию инфекционного заболевания у любого здорового человека. Условно-патогенные микроорганизмы вызывают заболевания преимущественно у людей с нарушенным иммунитетом.

Бактериологические исследования при заболеваниях, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, направлены на выделение всех микроорганизмов, находящихся в патологическом материале, что существенно отличает их от аналогичных исследований при заболеваниях, вызванных истинно патогенными микроорганизмами, когда проводится поиск определенного возбудителя.

Для получения адекватных результатов бактериологического исследования при гнойновоспалительных заболеваниях особенно важно соблюдать ряд требований при взятии биоматериала для анализа, его транспортировки в лабораторию, проведения исследования и оценки его результатов. Основные требования к взятию различных видов биоматериала на бактериологические анализы и его доставки обсуждены в главе 1.

13.1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДАХ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для идентификации вида возбудителя гнойно-воспалительных заболеваний и определения чувствительности к антибактериальным препаратам бактериологические лаборатории используют комплекс методов. Они включают микроскопическое исследование мазка (бактериоскопия) из доставленного биоматериала, выращивание культуры микроорганизмов (культивирование), идентификацию бактерий, определение чувствительности к антимикробным препаратам и оценку результатов исследования. Врач должен иметь представление о тех процедурах, которые проводятся в отношении биологического материала в бактериологической лаборатории.

Доставленный в бактериологическую лабораторию биоматериал первоначально подвергается микроскопическому исследованию.

Микроскопическое исследование мазка (бактериоскопия), окрашенного по Граму или другими красителями, проводят при исследовании мокроты, гноя, отделяемого из ран, слизистых оболочек (мазок из цервикального канала, зева, носа, глаза и т.д.). Результаты микроскопии позволяют ориентировочно судить о характере микрофлоры, ее количественном содержании и соотношении различных видов микроорганизмов в биологическом материале. Иногда микроскопия позволяет выявить микроорганизмы, плохо растущие на питательных средах. На основании данных микроскопии проводят выбор питательных сред для выращивания микробов, обнаруженных в мазке.

Культивирование микроорганизмов. Посев исследуемого биоматериала на питательные среды производят с целью выделения чистых культур микроорганизмов, установления их вида и

779

Источник KingMed.info

определения чувствительности к антибактериальным препаратам. Для этих целей используют различные питательные среды, позволяющие выделить наибольшее количество видов микроорганизмов. Оптимальными являются питательные среды, содержащие кровь животного или человека, а также сахарный бульон, среды для анаэробов. Одновременно производят посев на дифференциально-диагностические и селективные (предназначенные для определенного вида микроорганизмов) среды. Посев осуществляют на стерильные чашки Петри, в которые предварительно заливают питательную среду для роста микроорганизмов.

Чашки Петри с посевами инкубируют в термостате при определенных температурных, а для ряда микроорганизмов газовых (например, для выращивания анаэробов создают условия с низким содержанием кислорода) режимах в течение 18-24 ч. Затем чашки Петри просматривают. Количественную обсемененность доставленного биоматериала микрофлорой определяют по числу колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл или 1 мг исследуемого образца. При просмотре чашек Петри выявляют некоторые особенности изменения цвета среды, ее просветления в процессе роста культуры. Многие группы бактерий образуют характерные формы колоний, выделяют пигменты, которые окрашивают колонии или среду вокруг них. Из каждой колонии делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Оценивают однородность бактерий, форму и размер, наличие спор или других включений, капсулы, расположение бактерий, отношение к окраске по Граму. Вся эта информация служит важнейшей составляющей для выбора сред и получения в дальнейшем чистой культуры каждого микроорганизма.

Колонии отсевают на плотные, жидкие, полужидкие питательные среды, оптимальные для культивирования определенного вида бактерий.

Выделенные чистые культуры микроорганизмов подвергают дальнейшему изучению в диагностических тестах, основанных на морфологических, ферментативных, биологических свойствах и антигенных особенностях, характеризующих бактерий соответствующего вида или варианта.

Идентификация - комплекс бактериологических методов изучения бактерий, позволяющий определить вид микроорганизма.

Для подтверждения этиологической значимости выделенных бактерий для данного заболевания определение рода и вида, к которому они относятся, является обязательным для бактериологической лаборатории. Оно должно быть отражено на бланке результата исследования в виде наименования микроорганизма или его рода, например Streptococcus pneumoniae (пневмококк) или Eschrichia coli (кишечная палочка).

Определение чувствительности к антибактериальным препаратам. Чувствительность к антимикробным препаратам изучают у выделенных чистых культур микроорганизмов, имеющих этиологическое значение для данного заболевания. Поэтому в направлении на бактериологические анализы требуется указать диагноз заболевания у больного. Определение чувствительности бактерий к спектру антибиотиков помогает лечащему врачу правильно выбрать препарат для лечения больного.

Оценка результатов исследования. Принадлежность условно-патогенных микроорганизмов к естественной микрофлоре организма человека создает ряд трудностей при оценке их этиологической роли в развитии гнойно-воспалительных заболеваний. Условно-патогенные микроорганизмы могут представлять нормальную микрофлору исследуемых жидкостей и тканей или контами-нировать их из окружающей среды. Поэтому для правильной оценки результатов бактериологических исследований необходимо знать состав естественной микрофлоры изучаемого образца. В тех случаях, когда исследуемый биоматериал в норме стерилен, как,

780