Методы работы с белками 33

Д Аналитические методы работы с белками

Помимо вышеописанных методов существуют аналитические методы работы с белками: один из них — электрофорез.

Электрофорез́ разделяет белки на основании их миграции в электрическом поле. В полиакриламидном́ гелевом электрофорезе (PAGE) образцы белков поме-

щают на гелевую матрицу из полиакриламида и воздействуют на них электрическим полем. Матрица буферизована до щелочной среды, чтобы все белки были заряжены отрицательно1 и свободно мигрировали к аноду (он заряжен положительно). Обычно

1Белок всегда имеет заряд, если не находится в своей изоэлектрической точке, в которой pH среды вызывает ионизацию или деионизацию радикалов, и общий заряд белка в этом случае равен нулю (скомпенсирован). Есть белки, имеющие общий положительный и отрицательный заряд. К примеру, гистоны, с которыми связана ДНК у эукариот, заряжены положительно за счет избытка лизина и аргинина. В щелочных условиях анионы OH– способны отнимать протон у их радикалов. Для того, чтобы все белки двигались к аноду, их необходимо зарядить отрицательно (то есть вызвать депротонирование всех положительно заряженных радикалов). Для этого и используется щелочная среда в электрофорезе.

для сравнения миграции разных образцов используют некоторые стандартные образцы белков с известной массой. Матрица затрудняет движение крупных молекул белков, поэтому фракционирование происходит на основании двух показателей — заряда и матрицы.

Существует модификация стандартного метода электрофореза, в основе которой лежит использование отрицательно заряженного детергента додецилсульфата натрия (SDS). Его применяют для того, чтобы полностью «экранировать» (или компенсировать) нативный заряд белков так, чтобы фракционирование происходило только на основании массы. Полиакриламидный гелевый электрофорез (SDS-PAGE) используют для оценки чистоты образцов и молекулярного веса белков, которые в этих образцах содержатся (обычно их несколько) (см. Рис. 28 ▼). В этом методе додецилсульфат натрия добавляют к образцам и к полиакриламидному гелю. К белкам добавляют восстановительный агент, восстанавливающий все дисульфидные связи. Додецилсульфат натрия, имеющий длинную гидрофобную цепочку, связывается гидрофобными радикалами аминокислотных остатков в белке. Комплекс SDS-белок заряжается крайне отрицательно и мигрирует к аноду. Однако скорость их миграции в геле обратно пропорциональна логарифму их массы, а значит, крупные белки мигрируют медленнее, встречая на своем пути больше «сопротивления» со стороны геля. Малые молекулы белков мигрируют гораздо быстрее.

Стадии подготовки образцов и их анализ с помощью этого метода:

1.Подготовка образцов:

—Гомогенизация клеток (с помощью гомогенизатора или соника-

тора) и центрифугирование.

—Добавление к образцам денатурирующего агента (додецилсуль-

фата натрия). Это позволяет нарушить третичную и вторичную структуру белка и зарядить сами белковые молекулы отрицательно. Можно нагреть белки до ~100°C в присутствии восстановительного агента (например, дитиотреитола или 2-меркаптоэта- нола) для разрыва дисульфидных связей и полной денатурации белка.

2.Подготовка акриламидного геля:

—Готовят концентрирующий и разделяющий гель, обычно состоящий из акриламида, бисакриламида, додецилсульфата натрия и буфера с

заданным pH.

—Для удаления пузырьков воздуха к гелю добавляют бутанол или подвергают дегазации в вакууме.

—Далее необходимо начать полимеризацию геля. Для этого собирают систему для заливки, заливают гель, а затем добавляют к нему источник свободных радикалов и стабилизатор (например,

персульфат аммония и тетраметилэтилендиамин). Персульфат аммония образует в водном растворе радикалы NH4-SO4 за счет гомолитического разрыва связи. Начинается реакция полимеризации геля. В её основе — образование связей между бисакриламидом и двумя полиакриламидными молекулами. Поскольку реакция полимеризации акриламида – медленный процесс, то для

Методы работы с белками 35

ускорения процесса полимеризации в качестве катализатора обычно используют тетраметилэтилендиамин. Соотношение бисакриламида к акриламиду, как правило, составляет 1:35. Концентрация акриламида — 5–25%. Чем меньше молекулярная масса белков, тем большее количество акриламида нужно добавлять в гель. Гель будет иметь большую плотность и скорость движения белков в нём снизится до нужной отметки. Затем наслаивают примерно 100 мкл воды на гель для устранения пузырей. Гель затвердевает. Так готовят разделяющий гель. После этого вставляют гребёнку и заливают концентрирующий гель.

3.Сборка аппарата и подготовка образцов:

—Сначала собирают систему для электрофореза. Вынимают гребенку из застывшего концентрирующего геля и заливают катодный буфер в верхнюю часть камеры.

—Готовят образцы для электрофореза: смешивают анализируемые пробы с буфером для образцов в соотношении 1:1 и кипятят 5 мин.

—В полученные «карманы» геля осторожно наносят пробы, которые из-за разности в плотности с катодным буфером опускаются на дно кармашков. В нижнюю часть камеры заливают анодный буфер.

4.Проведение электрофореза:

—Полностью собирают систему для проведения электрофореза и подключают ее к источнику тока: сначала форез ведётся при токе 15 мА, после перехода лидирующего красителя из концентрирующего в разделяющий гель силу тока увеличивают до 30 мА (в случае использования стабилизации по напряжению – 50 В и 120 В, соответственно).

—Выключаем систему, после того как полоса лидирующего красителя дойдет до нижней границы геля.

5.Фиксация и окраска геля:

—Гель снимают со стекол и помещают в фисирующий раствор.

—Затем гель окрашивают и отмывают от избыточного фона краски. В роли красителя применяют кумасси бриллиантовый синий R- 250.

6.Анализ результатов:

—Фотографируют гель, используя систему гель-документирования (см. Рис. 29 ▼).

—Анализируют полученные результаты, используя специальные

программы.

Несмотря на то, что полиакриламидный гелевый электрофорез — аналитический метод, его можно адаптировать для очистки белков: вырезать фрагменты геля и отделять от него белки с помощью повторного воздействия электрического поля. После очистки белков от солей, их можно использовать в исследованиях, например, для структурного анализа.

Рис. 28. Электрофорез в полиакриламидном геле (SDS-PAGE).

Рис. 29. Снимок геля после электрофореза. Дорожки обозначены цифрами. Слева приводится молекулярная масса в кДа (в килодальто́ нах).

Методы работы с белками 37

Масс-спектрометри́я, как и следует из названия, определяет молекулярную массу белка (см. Рис. 30 ▼). Масс-спектрометр измеряет время, которое необходимо молекуле, находящейся в газовой фазе, чтобы попасть из точки введения на чувствительный детектор. Это время зависит от заряда молекулы и массы и выражается в виде отношения «заряд/масса» m/z. Ранее этот метод был неприменим к белкам и нуклеиновым кислотам ввиду того, что эти молекулы разрушались при переводе их в газовую фазу (нагревание, испарение и пропускание потока электронов).

Однако затем были разработаны модификации этого метода, в которых эти проблемы были устранены. Например, в электроспрейной масс-спектрометрии

раствор макромолекул распыляют из тонкой капиллярной трубки под большим напряжением (~4000 В) так, чтобы на выходе были заряженные капли, из которых растворитель быстро испаряется в вакуумных условиях. В результате макромолекулы переводятся в газовую фазу и имеют заряд от +0,5 до +2 на 1 кДа. Этот заряд объясняется протонированием аргинина и лизина. Далее ионы направляются на детектор магнитным полем.

Второй метод — матрично-активированная лазерная десорбция. В данном методе белки смешивают с химической матрицей, и смесь наносят на металлический субстрат (см. Рис. 31 ▼). Матрица — малая органическая молекула, поглощающая свет определенной длины волны (например, циано-4-гидроксикоричневая кислота/анилин). Лазерный импульс передает энергию на белки посредством этой матрицы. Белки десорбируются с субстрата и направляются на детектор. Масс-спектрометрия

— очень чувствительный метод, позволяющий определить массу белков вплоть до 10– 12 моль.

Рис. 30. Масс-спектрометрия.