48 |
Глава 2 |
Ферменты |
2.8Кинетика ферментативных реакций
В1913 году Леонор Михаэлис и Мод Ментен предложили простую модель кинетики ферментативных реакций:
Фермент E связывается с субстратом S, константа скорости этой реакции равна k1. Комплекс ES может диссоциировать до E + S со скоростью k–1 или образовать продукт E + P со скоростью k2. Кроме того, он может вновь образовать комплекс ES со скоростью k–2. Однако мы можем упростить эти реакции, приравняв скорость реакции к нулю (т.е. V0), когда можно пренебречь образуемым количеством продукта и, как следствие, обратной реакцией k–2[E][P] ≈ 0:
А Вывод уравнения Михаэлиса-Ментен (по Бергу)
Начнём с того, что скорость реакции равна произведению концентрации [ES] на константу скорости образования продукта k2:
V |
k |
2 |
ES |
0 |
|
|
Теперь выразим концентрацию [ES] известными нам параметрами: Скорость образования ES = k1[E][S]
(1)
Скорость распада ES = (k–1 + k2)[ES]
В 1924 году Джордж Бриггс и Джон Холдейн сделали допущение о равновесии реакции. В состоянии равновесия концентрации промежуточных продуктов — т.е. ES
— поддерживаются на одном уровне, даже если концентрации субстратов и продуктов реакции меняются. Это состояние достигается, когда скорости образования и распада ES равны. Приравняем правые части уравнений, указанных выше:
k |
1 |
E S k |
1 |
k |
2 |
ES |
|
|
|
|
Преобразуем это уравнение и получаем:
E S k 1 k2 ES k1
(2)
(3)
Это уравнение можно упростить, введя новую константу Km. Бриггс и Холдейн назвали её константой Михаэлиса:
K |
|
|
k |
1 |
k |
2 |
M |
|
|
||||
|
k |
|
||||
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
1 |
|
Теперь подставим константу Михаэлиса в уравнение 3:
ES E S KM
(4)
(5)
Кинетика ферментативных реакций 49
Посмотрим на числитель уравнения 5. Поскольку концентрация субстрата всегда значительно выше концентрации фермента, то концентрация несвязанного субстрата почти равна общей концентрации субстрата (общая концентрация [S] равна сумме связанного субстрата с ферментом и несвязанного субстрата). Концентрация несвязанного фермента [E] равна разности общей концентрации фермента и фер- мент-субстратного комплекса [ES].
E E |
T |
ES |
|
|
Выразим E в уравнении 5 через разность в уравнении 6. Получаем:
(6)
ES |
E |
T |
ES S |
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
K |
M |
|
|
|
|
|
(7)
Преобразуем уравнение 7. Раскрываем скобки и переносим Km из знаменателя правой части в левую часть уравнения.
ES K |
M |
E |
T |
S ES S |
|
|
|
Затем делим обе части уравнения на ES и сокращаем.
ES K |
M |
|
E |
T |
S ES S |
|
|
|
|||
|
|
|
|
||
ES |
|
|
|
|
ES |
K |
|
|
E |
T |
S |
S |
|
M |
|
|
|
|
|
|
|
ES |
|
|||
|
|
|
|
|||
Переносим S из правой части в левую.
KM S ET S
ES
(8)
(9)
(10)
(11)
Переносим ES из правой части (из знаменателя) в левую (в числитель). Km + S переносим из левой части в правую (в знаменатель). Получаем:
ES |
E |
T |
S |
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
K |
M |
S |
|
|
|
|
||
Теперь выразим ES в уравнении 12, используя уравнение 1:
ES V0 k2
V0 |
|
ET S |
|
k2 |
KM S |
||
|
(12)
(13)
50 |
Глава 2 |
Ферменты |
V |
k |
|
E |
|
|
S |
|
2 |
T |
|
|
||||
0 |
|
|
K |
|
S |
||
|
|
|
|
|
M |
||
|
|
|
|
|
|
|
|
(14)
Максимальная скорость ферментативной реакции Vmax достигается, когда все каталитические центры фермента заняты (концентрация насыщения) субстратом. Т.е.
[ES] = [ET].
V |
k |
2 |
ES k |
2 |
E |
T |
max |
|
|
|
(15)
Теперь подставим Vmax из уравнения 15 Михаэлиса-Ментен:
V |
V |
|
S |
|
|
|
|||
0 |
max |
K |
|
|
|
|
M |
||
|
|
|
|
|
в уравнение 14. Получаем уравнение
S |
(16) |
|
БЗначения константы Михаэлиса
1.Константа Михаэлиса характеризует сродство фермента к субстрату. Чем ниже значение Km, тем прочнее фермент связывается с субстратом. Это значит, что фермент, у которого низкое значение константы Михаэлиса, будет прочнее и быстрее связывать субстрат (а, следовательно, и реакция быстрее достигнет половины максимальной скорости). Тот фермент, у которого значение константы высоко, будет слабо связывать субстрат (а значит, и скорость реакции будет ниже). Сродство фермента к субстрату связано с особенностями их строения. Чтобы компенсировать низкое сродство достаточно добавить ещё субстрата, увеличив, таким образом, частоту и вероятность успешного взаимодействия активного центра фермента с ним.
2.Константа Михаэлиса Km равна концентрации субстрата, при которой скорость реакции составляет половину максимальной (Vmax/2).
3.Константа Михаэлиса Km равна соотношению констант скоростей прямой и об-
ратных реакций (k–1 + k2)/k1.
|
Кинетика ферментативных реакций |
51 |
Низкое сродство |
Высокое сродство |
|
фермента к субстрату |
фермента к субстрату |
|
Фермент плохо связывает субстрат |
Фермент хорошо связывает субстрат |
Образуется мало комплексов [ES], а, |
Образуется много комплексов [ES], а, |
следовательно, мало продукта |
следовательно, много продукта |
Скорость реакции низкая |
Скорость реакции высокая |
В Уравнение Лайнуивера-Берка
Каталитическая константа (kcat) —
это количество обращений фермента — максимальное количество молекул субстрата, которое может быть трансформировано в продукт одной молекулой фермента за единицу времени. Соотношение kcat/Km является мерой каталитической эффективности фермента.
Уравнение Михаэлиса-Ментен (математический вывод — Бриггс и Холдейн):
V0 |
Vmax [S] |
|
|
|
K [S] |
|
|
|
|
|
Рис. 34. |
График Михаэлиса-Ментен |
||
|
m |
|||
|
|
|
||
|
|
|
|
|
На практике этим уравнением и графиком Михаэлиса-Ментен очень тяжело пользоваться, поскольку точно определить значения максимальной скорости Vmax и константы Ми-
хаэлиса Km они не позволяют (см. Рис. 34 ).
В связи с этим Лайнуивер и Берк, используя метод двойных обратных величин, трансформировали это уравнение следующим образом: