сайтов и блокирует действие белка DnaB (хеликаза) — препятствует раскручиванию двойной спирали ДНК.

4.5 Репликация у эукариот

Эукариоты содержат более 10 ДНК-полимераз, которые объединяют в 6 семейств: A, B, C, D, X и Y. Сами полимеразы обычно называют греческими буквами. ДНК-полимераза α синтезирует праймеры, высокопроцессивная ДНК-полимераза δ синтезирует запаздывающую цепь, ДНК-полимераза ε синтезирует лидирующую цепь и может заменить ДНК-полимеразу δ в синтезе запаздывающей цепи. ДНКполимераза β участвует в репарации ДНК. Скорость репликации у эукариот в 10 раз ниже, чем у прокариот. Эукариотическая ДНК имеет множество точек ori. У эукариот имеются аналоги бактериальных белков, участвующих в репликации:

1.Белковый MCM-комплекс выполняет роль хеликазы — аналогичен

DnaA.

2.RPA-белки (replication protein A) связываются с цепями ДНК подобно SSB-белкам у прокариот.

3.Ферменты РНКаза H1 и FEN1 (flap endonuclease-1) действуют как прокариотическая ДНК-полимераза I (т.е. вырезают праймер).

4.Белок PCNA (пролиферирующий клеточный ядерный антиген) является аналогом «β -хомута» прокариот.

4.6Проблемы репликации

АПроблема образования супервитков ДНК

Входе репликации возникают положительные супервитки и торсионное напряжение на цепях ДНК, которые снимаются ферментами ДНК-гиразами (ДНКтопоизомеразами II). Это необходимо для того, чтобы полимераза могла продолжать движение по цепи ДНК — супервитки этому препятствуют.

Б Проблема высокой точности процесса

Точность самой полимеразной реакции была определена в ходе исследований in vitro. ДНК-полимераза совершает 1 ошибку на каждые 104–105 нуклеотидов. Т.е. 1 нуклеотид из 10 000 оказывается некомплементарным нуклеотиду в родительской цепи.

Исследованиями было доказано, что общая частота ошибок репликации у кишечной палочки E. coli составляет 1 на каждые 109–1010 нуклеотидов. Такой хороший показатель достигается двумя основными факторами (в комплексе с достаточно низкой частотой ошибок самой ДНК-полимеразы):

1.После каждого цикла полимеразной реакции ДНК-полимераза «определяет», образовалась ли комплементарная пара между новым нуклеотидом в дочерней цепи и нуклеотидом родительской. Если нет, то она «делает шаг назад» и вырезает только что присоединённый некомплементарный нуклеотид. Иными словами, ДНК-полимераза проявляет

Проблемы репликации 91

3’→5’ экзонуклеазную активность. Она позволяет снизить обычную частоту ошибок полимеразы с 1 на каждые 104–105 нуклеотидов до 1 на каждые 106–108.

2.Однако и этого недостаточно, чтобы объяснить ещё более высокую точность репликации, которая отмечается in vivo. Дополнительным фактором служит отдельная система репарации — комплекс ферментов, которые «сканируют» цепи ДНК на наличие ошибок и исправляют их в случае обнаружения.

ВПроблема репликации генома у эукариот

Как правило, геном одной эукариотической клетки состоит из множества молекул ДНК общей длиной до нескольких миллиардов нуклеотидных пар (в каждой соматической ядерной клетке человека — 23 пары хромосом — 3,2 миллиарда нуклеотидов).

Скорость репликации у эукариот невысока (~100 нуклеотидов в секунду), поэтому репликация такого объёма ДНК заняла бы месяцы или даже годы. Эта проблема решается множественностью точек ori. Т.е. репликация у эукариот начинается сразу во многих точках и идёт параллельно.

ГПроблема репликации 3’-конца родительской цепи ДНК

ДНК-полимераза не может полностью реплицировать 3’-конец родительской цепи. Это объясняется тем, что праймер, присоединённый к 3’-концу, разрушается ферментами, удаляющими любые рибонуклеотиды, связанные с ДНК. Для этого эукариоты выработали особые структуры, позволяющие защитить ДНК от укорочения — теломеры. Они представляют собой последовательности нуклеотидных остатков на концах ДНК, состоящие из 300 и более нуклеотидов (у людей — несколько килобаз повторов TTAGGG). Теломеры синтезируются особым ферментом теломеразой (комплекс белка и РНК). Фрагмент РНК, входящий в состав теломеразы, комплементарен теломерной последовательности нуклеотидов и служит матрицей в их синтезе. Теломеразы активны только в стволовых клетках и некоторых лейкоцитах. В других клетках эти ферменты не активны, и удлинения теломер не происходит.

В каждом цикле репликации теломеры на концах ДНК укорачиваются примерно на 50–250 нуклеотидов. Как только укорочение теломер становится критическим, клетка может пойти по одному из нескольких сценариев: например, может начаться процесс программируемой клеточной гибели — апоптоз.

Как правило, теломеры отсутствуют у большинства прокариот — их ДНК кольцевая, поэтому необходимости в них нет. Однако у бактерий родов Streptomyces и Borrelia, имеющих линейную ДНК, они есть. При этом они отличаются по структуре и функциям от эукариотических.