19.2. Иммобилизованные ферменты

Иммобилизация ферментов - это повышение их стабильности. В биологических объектах ферменты находятся в фиксированном состоянии на поверхности различных клеточных структур и сохраняют активность в течение длительного времени. В то же время выделенные из органов и тканей или полученные из микробного сырья, особенно в высоко очищенном состоянии, они быстро инактивируются. Поэтому повседневное клиническое использование натнвных ферментов лимитируется прежде всего их высокой лабильностью к различным факторам окружающей среды (значение рН, температура и др.), быстрой инактивацией в организме и выделением из организма, что повышает расход ферментов, а также наличием антигенных свойств чужеродных организму белков. Перечисленные недостатки в значительной степени могут быть устранены при использовании ферментов в иммобилизованном виде.

При создании иммобилизованных ферментов, применяемых в медицине, определили два направления:

1) когда присутствие фермента необходимо в разных органах или он предназначен для длительной циркуляции в кровотоке, получают его стабилизированные водорастворимые формы. К этой группе могут быть отнесены и искусственные клетки, наполненные ферментами: микрокапсулы, липосомы и клетки крови;

2) при лечении очаговых заболеваний целесообразны иммобилизованные ферменты, которые могут быть локализованы в определенном месте организма и способны к его выделению с заданной скоростью в окружающую среду. Однако необходимость введения иммобилизованного фермента в организм отпадает, если он действует на субстрат, присутствующий в биологических жидкостях. В этих случаях используют системы экстракорпоральной перфузии, помещая иммобилизованный фермент в закрытую систему, через которую циркулирует биологическая жидкость (кровь, лимфа и др.), возвращающаяся в организм освобожденной от вредного метаболита.

Водорастворимые препараты иммобилизованных ферментов. Высокомолекулярные водорастворимые производные ферментов на данном этапе развития медицинской энзимологии являются их наиболее рациональными формами. Фермент и полимер, как правило, соединены ковалентной связью. Молекула фермента обволакивается макромолекулой полимера в результате образования между ними 6-10 ковалент-ных связей. Многоточечное взаимодействие фермента с носителем делает его конформацию более жесткой и менее подвижной. Фермент оказывается заключенным в полимерную оболочку, имеющую вид петель и достаточно хорошо проницаемую для высокомолекулярных субстратов. Поэтому такие соединения получили название «открытые» макромолекулярные капсулы. Водорастворимые полимерные производные ферментов характеризуются повышенной стабильностью in vitro и in vivo, увеличенным временем циркуляции в кровотоке, что обусловливает пролонгирование их действия в организме. Они оказывают менее выраженное побочное действие, что связано с пониженной по сравнению с нативными ферментами способностью стимулировать образование антител и реагировать с ними вследствие затруднений для специфического взаимодействия антиген - антитело.

Положительные качества ферментов, модифицированных водорастворимыми полимерами, открывают широкие перспективы для их клинического использования. Определенные успехи в этом направлении достигнуты при применении в клинике иммобилизованных протеаз в качестве фибринолитических и противовоспалительных препаратов. Особое значение в этой связи приобретают разработка и внедрение в клинику стрептодеказы.

Стрептодеказа для инъекций (Strep-toclecasum pro injectionibus) - первый препарат пролонгированного действия для тромболитической терапии, полученный на основе иммобилизованного фибри-нолизина (стрептокиназы) и разрешенный к медицинскому применению в 1981 г. Над созданием препарата работали коллективы ВНИИ ТИАФ, Всесоюзного кардиологического научного центра (ВКНЦ) АМН СССР и ИОС АН Латвии.

В качестве водорастворимого полимера-носителя для иммобилизации стрептокиназы использован дек-стран с м.м. 60 000, выпускаемый под названием полиглюкин. Предварительное активирование иоли-глюкина проводят калия периодатом при комнатной температуре и перемешивании раствора в течение 1 ч. Очистку окисленного полиглюкина от примесей осуществляют хроматографической адсорбцией.

Для иммобилизации стрептокиназы к ее раствору приливают раствор окисленного полиглюкина, имеющего значение рН 8,7, и перемешивают в течение 1 ч. Аминогруппы стрептокиназы и альдегидные группы окисленного полиглюкина взаимодействуют с образованием азометиловой связи. Затем реакционную смесь охлаждают до 4°С. Последующее восстановление стрептодеказы проводят при добавлении к реакционной массе натрия боргидрида и перемешивании в течение 1 ч при температуре 4°С. Азометиловые связи (-CH-N-) между полимером и белком восстанавливаются до Н₂С-NH-связей, а избыток аль

I I

дегидных групп полимера (реакционные группы, оставшиеся после реакции) - до гидроксильных. После определения фибринолитической активности раствор концентрируют с помощью ультрафильтрации. Концентрат подвергают стерилизующей фильтрации и затем .сублимационной сушке.

Препарат представляет собой порошок или пористую массу белого цвета. Выпускают в герметически укупоренных флаконах вместимостью 10 мл, содержащих по 1 500 000 или 1 000 000 ФЕ (фибринодитиче-ских единиц) стрептодеказы (в пачках по 2 флакона). Хранят по списку Б, при температуре не выше 10°С. Стрептодеказу обычно в дозе 2 700 000 ФЕ (через 1 ч после пробной инъекции 300 000 ФЕ) вводят однократно, внутривенно, струйно, растворяя непосредственно перед применением в 20-50 мл изотонического раствора натрия хлорида. В этой дозе препарат вызывает значительное повышение фибриполнти-ческой активности крови и действует в течение 48-72 ч.

Включение ферментов в микрокапсулы. Микро-капсулирование ферментов состоит во включении их водных растворов в полупроницаемые мембраны толщиной около 20 им, непроницаемые для ВМС и клеток, но через которые могут проникать низко-молекулярные вещества. Наличие ультратонкой мембраны позволяет создать высокие концентрации фермента в малых объемах раствора, находящегося в микрокапсуле, и сохранять стабильность и биологическую активность инкапсулированных ферментов. Использование фермента в высоких концентрациях, а также большие значения отношения площади поверхности микрокапсул к их объему обеспечивают быструю диффузию низкомолекулярного субстрата из внешней среды к ферменту и продукта реакции из внутреннего объема микрокапсулы в межкапсулярное пространство.

Получены и исследованы микрокапсулнрованные формы ряда ферментов, катализирующих различные превращения ннзкомолекулярных субстратов. Так, микрокапсулированная каталаза, введенная внутривенно или внутрмбрюшпнно мышам с наследственным нарушением синтеза этого фермента, эффективно снижала содержание перборатов в крови и имела более длительный период жизни в организме, чем свободный фермент. Микрокапсулированная аспара-гиназа, введенная мышам с аспарагинзависимыми опухолями, вызывала стойкое и длительное снижение аспарагина в крови, что препятствовало росту злокачественных новообразований. Микрокапсулированная уреаза после введения крысам в желудочно-кишечный тракт вызывала существенное понижение содержания мочевины в крови. Следует отметить, что все исследования микрокапсул и рованных ферментов проводятся только на животных. Это связано с тем, что при иитракорпоральном их введении материал, используемый для создания мембран, накапливается в основном в селезенке и печени и может быть далеко не безразличен для организма.

Идеальным материалом с точки зрения биологической утилизации микрокапсул в организме человека и животных могут быть различные природные мембраны клеток крови. Фермент при относительно мягких условиях (нейтральная среда, небольшая ионная сила и т.д.) может быть заключен в частично гемоли-зованные клетки крови (эритроциты, тромбоциты) с последующим восстановлением целостности их мембран. Поскольку размер ферментных элементов крови мал, а время жизни их в кровяном русле относительно велико, такие микрокапсулы могут беспрепятственно и длительно циркулировать в крови. В форменные элементы крови включены такие ферменты, как |3-глю-козидаза, Р-галактозидаза, а-амилаза, пероксидаза, аргиназа, аспарагиназа и некоторые другие. Все иммобилизованные в клетки крови ферменты имеют неизменяемые каталитические параметры п отличаются большей устойчивостью к повышению температуры.

Применение микрокапсул, содержащих ферменты, экстракорпорально через шунты или камеры имеет хорошую перспективу. Одно из преимуществ состоит в том, что не происходит контакта фермента с им м у некомпетентным и клетками, тем самым исключается возмодность сенсибилизации организма со всеми неблагоприятными последствиями. Кроме того, применение вне организма исключает накопление в нем искусственных клеток и снимает проблему разрушения и утилизации полимерных материалов. Благодаря ультратонкой полупроницаемой мембране и высоким значениям отношения площади поверхности микрокапсул к их объему, скорость диффузии низкомолекулярных веществ через микрокапсулы выше, чем через диализную мембрану в аппарате искусственная почка. Принцип энзиматического превращения вредных метаболитов с помощью микрокапсулирован-ных ферментов разрабатывается для применения в аппаратах искусственная почка и искусственная печень. Перспективным может оказаться использование микрокапсулированных ферментов для удаления мочевины - одного из самых токсичных метаболитов клетки. Одним из способов является превращение мочевины под действием микрокапсулированной уреа-зы в аммоний и углерода диоксид. Вторым - использование экстракорпорального шунта, снабженного микрокапсулами с мультиферментными рециклиру-ющими комплексами. С помощью таких микрокапсул, благодаря сложной цепи рециклирующих реакций, мочевина и аммоний превращаются в аминокислоты: глутамат, оксиглутарат, аланин.

Включение ферментов в липосомы. Лнпосомы - биелойные сферические образования с водной фазой внутри и размером несколько сотен ангстрем или полибислойные образования, состоящие из нескольких концентрических бислоев с внутренней полостью и размером до многих сотен ангстрем и даже до 1 мкм. Для получения липосом ферменты или другие биологически активные вещества в водных растворах подвергают ультразвуковой обработке в присутствии положительно или отрицательно заряженных фосфо-липидов.

Липосомы после разрушения составляющих их фосфолипидов могут быть утилизированы как компоненты клеточных мембран. Кроме того, они дают уникальную возможность введения фермента внутрь клеток, с которыми взаимодействуют. В зависимости от физических параметров фосфолипидов (заряд, жидкость, размер) липосомы проникают в клетку посредством эндоцитоза или за счет слияния с природными мембранами. При эндоцитозе липидная оболочка липосом внутри клеток разрушается фосфо-липазами лизосом и лекарственное вещество освобождается в цитоплазму; при слиянии с клеточной мембраной липидиый компонент липосом входит в состав клеточных мембран, а его лекарственное содержимое поступает в цитоплазму.

Распределение липосом по различным органам при их введении животным детально изучено. Основная их часть (от 50 до 80%) поглощается клетками ре-тикулоэндотелиальной системы, в первую очередь находящимися в печени и селезенке. Свойство липосом избирательно-концентрироваться в клетках ретикуло-эндотелиадьной системы использовано для лечения генетически обусловленных нарушений синтеза и функционирования лизосомальных гидролаз печени. При этом следует отметить, что пораженная печень накапливает в несколько раз больше липосом, чем здоровая. При лечении ферментом, включенным в липосомы, больного с дефицитом лизосомальной а-глкжо-зидазы, сопровождающимся усиленным накоплением гликогена в печени, наблюдали быстрое (в течение недели) снижение уровня гликогена и уменьшение размера печени. Положительный терапевтический эффект на людях отмечен при использовании включенной в липосомы глюкоцереброзидазы при болезни Гоше, связанной с нарушением метаболизма глюко-цереброзидов, накапливающихся в клетках ретикуло-эндотелиальной системы в результате дефицита соответствующего лизосомального фермента.

Направленность действия лилосом (органотроп-ность) может быть изменена при изменении состава компонентов, образующих мембрану, а сродство ли-посом к клеткам-мишеням усилено с помощью специфических факторов (антитела, лектины и др.).

Препараты иммобилизованных ферментов, применяемые при локальных заболеваниях. При локальных заболеваниях целесообразно использование иммобилизованных ферментов, которые могут быть локализованы в определенном месте организма и способны к постепенному выделению в окружающую среду. При получении таблеток и гранул ферментных препаратов (трипсина, лизоцима, щелочной фосфатазы, ка-талазы и др.) предложено вводить их в смеси с биосовместимыми полимерами (полиакриламидом, поли-впнилпирролидоном, спиртом поливиниловым и др.). Имплантированный в очаге поражения или поблизости от него находящийся в полимере фермент практически полностью защищен от воздействия агрессивной физиологической среды. Вместе с тем из полимера фермент выходит в нативном состоянии и скорость его последующей инактивации и выведения, как и вызываемые им токсические, аллергические и иммунные реакции, та же, что и для нативного фермента, применяемого традиционным способом.

Перспективны рассасывающиеся в организме фер-ментосодержащие препараты, которые с помощью катетеризации могут вводиться непосредственно в мышечную ткань или капиллярную сеть пораженного органа и поддерживать там высокую локальную концентрацию стабилизированного фермента.

В качестве полимерного носителя использовали сефадекс, который предварительно окисляли кислотой йодной или натрия перйодатом. Полученные при окислении альдегидосефадексы способны к медленному растворению. Изменение степени окисления позволяет варьировать их растворимость в самых широких пределах. Иммобилизованный на таком носителе фермент переходит в раствор ковалентно связанным с осколком (фрагментом) носителя, который не только дополнительно его стабилизирует, но и уменьшает вызываемые ферментом нежелательные реакции организма.

Иммобилизованные на частично окисленных полисахаридах тромболитические фермент ы показали большую перспективность для терапии тромбозов. Лизис тромба достигается меньшей дозой иммобилизованного фермента, депонируемого непосредственно в месте расположения тромба методом катетеризации.

К биодеградируемым препаратам могут быть отнесены ферменты, иммобилизованные в структуре полимерных волокон и пленок в процессе их формирования. Различают обычные и полые волокна. Для получения обычных волокон к раствору полимера (триацетатцеллюлоза, нитроцеллюлоза, этил целлюлоза, поливинилхлорид и др.) в органическом растворителе добавляют водный раствор или суспензию фермента. Смесь эмульгируют и продавливают через мелкое сито в коагулируемую жидкость. Образующиеся волокна представляют собой полимерные гели, которые содержат в структуре водный раствор фермента. Полые волокна изготавливают из природных или синтетических полимеров, таких как целлюлоза, поливинилхлорид, полисульфон, полиакрил амид, нейлон. Полые волокна состоят из основной массы полимерной матрицы, которая имеет внутреннюю полую область, заполненную раствором фермента. Он удерживается в полой области волокна за счет физической иммобилизации или химической связи между аминогруппами фермента н активными группами, находящимися на внутренней поверхности волокна. Каталитические свойства ферментов, включенных в волокна, используются в медицине в экстракорпоральных шунтах для детоксикации организма при различных патологических состояниях и в терапии субстрат-зависимых опухолей, а также в ферментативных реакторах при диагностических определениях концентрации метаболитов в крови. Так, уреаза, включенная в волокна из триацетатцеллюлозы, химически сшитая с помощью глутарового альдегида с нейлоновыми трубками, эффективно снижала уровень мочевины в крови животных. Уреаза, иммобилизованная на нейлоновых трубках, оказала положительный терапевтический эффект при лечении больных, страдающих гиперуриксмией, обеспечив быстрое удаление уратов из кровяного русла. Подсоединение экстракорпоральных шунтов, содержащих аспарагиназу, включенную в волокла из трнацетатцеллюлозы и дакрона или ко-валентно пришитую за счет глутарового альдегида к внутренней поверхности нейлоновых трубок, приводило к полному удалению аспарагина из кровяного русла животных.

Протеолитические ферменты, включенные в систему нерастворимых (фторопласт-42 и др.) и растворимых (ПВС и др.) в воде полимеров, используются при гнойных ранах. Фермент выделяется благодаря диффузии или постепенному растворению пленки. Применение полимерных пленок ускоряет очищение ран в 3-4 раза, расход фермента на курс лечения снижается приблизительно в 20 раз.

Контрольные вопросы

1. Перечислите ферментные препараты, получаемые из микроорганизмов.

2. Объясните особенности выделения внеклеточных и внутриклеточных ферментов из микроорганизмов.

3. Укажите способы иммобилизации, наиболее рациональные для ферментов.

4. Назовите особе!!ности биодеградируемых ферментных препаратов.

5. Как получают стрептодеказу? В какой лекарственной форме ее выпускают? Как применяют?