Глава 19 ферменты микробиологического синтеза. Иммобилизованные ферменты
19.1. Ферменты микробиологического синтеза (ферменты, синтезируемые микроорганизмами)
Получение ферментов из культур микроорганизмов является перспективным ввиду неограниченной доступности исходного сырья - бактерий, грибов и актиномицетов. Большие возможности открываются при отборе и искусственном мутагенезе продуцентов для направленного биосинтеза определенных ферментов. Биосинтетические методы отличаются высокой производительностью за счет способности микроорганизмов к интенсивному размножению. Известны бактерли, которые делятся каждые 30-60 мин, в результате чего происходит быстрое накопление целевых продуктов в биомассе или культуральной среде. Поэтому, несмотря на ряд лимитирующих факторов, методы биотехнологии являются экономически более эффективными, чем методы получения биологически активных веществ из дорогого и дефицитного животного сырья.
Биотехнологический процесс включает большую подготовительную работу: очистку и стерилизацию воздуха, посуды и аппаратов; подготовку питательной среды для биосинтеза и ее стерилизацию; выращивание посевного материала исходной культуры. Засев производственной питательной среды и выращивание микроорганизмов (продуцентов ферментов) проводят в ферментаторе. Культивирование микроорганизмов осуществляют в основном глубинным способом в жидкой питательной среде при строго определенном значении рН, времени и температуры, подавая стерильный воздух.
Большинство ферментов промышленного производства относится к внеклеточным, поэтому накапливаются в культуральной жидкости, что значительно упрощает их выделение (схема 19.1). Культуральную жидкость отделяют от частиц мицелия фильтрованием через синтетические ткани, применяемые в пищевой промышленности и обладающие механической и химической прочностью. С целью улучшения процесса фильтрации используют дополнительный фильтрующий слой из материалов, имеющих высокие гидродинамические свойства - перлит, уголь активированный и др. Для повышения качества фильтрата по цветности и прозрачности применяют соосажде-ние мелкодисперсных взвешенных частиц мицелия и высаливание балластных веществ аммония сульфатом. Осветление растворов проводят микрофильтрацией через мембраны с диаметром пор от 0,45 до 0,8 мкм. Снижение микробной контаминации осуществляют стерильной фильтрацией через мембраны с диаметром пор от 0,1 до 0,3 мкм.
СХЕМА 19.1. Технология ферментов, получаемых биотехнологическими методами
При выделении изоферментов (внутриклеточных) основной задачей является сбор клеток, содержащих фермент, с последующей их промывкой буферным раствором. Наилучшие результаты отделения клеток обеспечивает микрофильтрация через мембранные фильтры с диаметром пор 0,45 мкм. Осуществляют ее в тангенциальном потоке, при котором фильтруемая жидкость подается под небольшим углом к поверхности мембраны, что позволяет постоянно смывать слой частиц, образующихся на ее поверхности. Его удаление происходит также за счет высокой скорос ги подачи исходного раствора в фильтрующую систему. Таким путем удается переработать большие объемы растворов и получить высококонцентрированные суспензии.
Следующей стадией выделения внутриклеточных ферментов, (например, аспарагиназы, пенициллиназы) является разрушение клеток путем механической, гидродинамической или ультразвуковой дезинтеграции или лизиса с помощью ферментов и другими способами. Очищают растворы микрофпльтрацией через мембранные фильтры с размером пор 0,22 мкм. Так как целевым компонентом является фильтрат, то наряду с фильтрацией в тангенциальном потоке используют и обычную - через патронные фильтры. Из растворов ферменты выделяют фракционированием нейтральными солями и растворителями, а также изо-электрическим осаждением.
Одним из прогрессивных методов очистки является ультрафильтрация, позволяющая проводить разделение в соответствии с размером молекул или молекулярной массой веществ.ч Основной характеристикой ультрафильтрацпонной мембраны является средний предел полного деления частиц глобулярного белка, которые не проходят через мембрану. Наличие широкого набора мембран с пределами отсечения от I тыс. до 1 млн дальтон (обычно I, 10, 30 тыс. и 1 млн) позволяет отделять различные примеси, очищать, концентрировать и обессоливать целевой продукт. Ультрафильтра цпя осуществляется о тангенциальном потоке, обессоливапне или удаление низкомолекулярных примесей (м.м. ниже предела деления мембраны) - в режиме днафильтрации, т. е. при постоянном объеме фильтруемой жидкости, за счет восполнения фильтрата равным объемом воды или буферного раствора.
Важную роль в технологии выделения и очистки ферментов играют хроматографическис методы. Они включают гель-фильтрацию или эксклюзионную хроматографию, когда время выхода вещества из хро-матографической колонки зависит от размера его молекул или молекулярной массы (более крупные молекулы не входят в поры сорбента и элюнруются раньше); ионообменную хроматографию, разделение при которой основано на различиях в суммарных зарядах присутствующих веществ при данном значении рН
(вещества, имеющие большой заряд, удерживаются сильнее и элюируются позже); обращенно-фазовую или гидрофобную хроматографию, при которой гидрофобные вещества сильнее связываются с поверхностью сорбента и элюируются позже. При очистке ферментов используют один или несколько из указанных методов хроматографического разделения.
Перспективной для выделения и очистки ферментов является аффинная хроматография, разделение с помощью которой основано на том, что один из компонентов смеси обладает повышенной способностью к связыванию с лигандом, присоединенным ковалент-ной связью к инертному носителю. При пропускании смеси белков или культуральной жидкости через колонку, заполненную таким сорбентом, молекулы соединения, обладающие сродством к лиганду, удерживаются в колонке, в то время как другие выходят из нее. Вещество из колонки селективно элюируют с помощью буфера, содержащего лиганд или его аналог, иногда с добавлением какого-либо растворителя.
Препараты ферментов микробиологического синтеза. Террилитин (Terrilytinum) -препарат содержит очищенный протеолитический фермент, получаемый из культуры плесневого гриба Aspergillus terri-cola. Он первый лекарственный микробный фермент, освоенный в 1976 г. отечественной промышленностью по разработкам Всесоюзного научно-исследовательского технологического института антибиотиков и ферментов медицинского назначения (ВНИТИАФ). Подобно большинству белковых препаратов микробного происхождения является комплексным препаратом, представленным тремя протеазами, из которых основное содержание, около 90%, составляет протеаза-1. Молекулярная масса террилитина 26 800, область стабильности при значении рН 4,0-9,0.
Террилитин представляет собой лиофилизирован-ный порошок или пористую массу белого цвета, легко растворим в воде, значение рН I% водного раствора 4,8-6,5; активность, выраженная в протеоли-тических единицах (ПЕ), должна быть не менее 2 в 1 мг. Препарат выпускают в герметически укупоренных флаконах по 200 ПЕ, хранят по списку Б, в сухом, защищенном от света месте, при температуре не выше 4°С. Применяют наружно и в виде ингаляций для расщепления гнойных экссудатов, некротических тканей, при лечении гнойных ран, ожогов, заболеваний верхних дыхательных путей.
Ораза (Orazum)-содержит комплекс амило-литических (амилазы, мальтазы) и протеолитическпх ферментов, получаемых из культуры гриба Aspergillus oryzae. Препарат представляет собой аморфный порошок от светло-желтого до темно-желтого цвета, растворимый в воде, устойчив в интервале значений рН 2,5-9,0. Для медицинских целей его получают из технического продукта амилоризина-ПХ, высушенной и измельченной поверхностной культуры плесневого гриба Aspergillus oryzae, извлеченной водной экстракцией с последующей фракционной очисткой органическими растворителями. Выпускают препарат в форме гранул по 100 г в стеклянных банках. Хранят в сухом, прохладном месте. Применяют при расстройствах пищеварения, протекающих с угнетением функции пищеварительных желез.
Солизим (Solizymum) -ферментный препарат л и политического действия, полученный из культуры гриба Penicillium solitum. Он представляет собой гигроскопический порошок светло-коричневого цвета со слабым специфическим запахом, мало растворимый в воде и практически нерастворимый в этаноле, хлороформе, эфире. Область стабильности при значении рН 6,5-9,5. Активность препарата определяют по способности гидролизовать эмульсию масла оливкового и выражают в ЛЕ (липолитических единицах).
Солизим выпускают в таблетках с содержанием 20 000 ЛЕ. Таблетки получают гранулированием со-лизима и сахара 5% раствором ПВП в хлороформе в установке с псевдоожижением вещества, сушат при температуре не выше 40°С, покрывают оболочкой из ацетилфталилцеллюлозы в спирто-ацетоновом растворе с добавлением красящих веществ. Благодаря оболочке таблетки выделяют фермент лишь в верхних отделах кишечника. Хранят в сухом, защищенном от света месте, при температуре не выше 4°С. Применяют при хронических заболеваниях желудочно-кишечного тракта и панкреатитах.
Стрептолиаза (Streptoliasum) - препарат, содержащий фермент стрептокиназу, получаемый из культуры ^-гемолитического стрептококка группы С. Лиофиллизированный препарат представляет собой пористую массу белого цвета, легко растворимую в воде. Активность стрептолиазы выражают в ЕД. За ЕД принимают количество, лизирующее в определенных условиях сгусток фибрина, образованный смесью растворов фибриногена и тромбина. Выпускают в ампулах по 250 000 и 500 000 ЕД. Хранят при температуре от 4 до 10°С. Применяют в качестве фибрпно-литпческого (тромболитического) средства. Недостатком является малая стабильность в организме: период полураспада стрептокипазы составляет 20-80 мим, ввиду чего препарат вводят внутривенно (в необходимых случаях - внутриартериально) капельно на протяжении 16-18 ч. Высокая иммунная активность является причиной побочных эффектов (озноб, лихорадка, аллергические реакции). Препарат стрептокипазы, лишенный указанных недостатков, получен ее иммобилизацией на водорастворимой полисахаридной матрице (см. стрептодеказу).
А с п а р а г и 11 а з a (Asparaginasum) - L-acna-рагипаза (L-аспарагин-аминогидролаза) - фермент, расш.епляющпй аспарагин на кислоту аспарагииовую и аммиак. Продуцируется разными штаммами кишечной палочки (Escherichia coli). Технология парентерального препарата L-аспарагнназы из Е. coli разработана совместными исследованиями Института органического синтеза (ИОС) АН Латвийской ССР и ВНИИ антибиотиков. Он представляет собой белый аморфный порошок, легко растворимый в воде и изотоническом растворе нагрия хлорида. В качестве стабилизатора содержит глицин. Активность выражается в международных единицах действия (ME). За МЕ принято количество фермента, освобождающее 1 мкмоль аммиака из аспарагина за 1 мин. Препарат выпускают в -лиофилизированном виде во флаконах, содержащих по 3000 и 10 000 ME L-аспарагииазы для инъекций. Хранят по списку Б, при температуре не выше 10°С. Применяют при лечении острой лимфо-бластической лейкемии. Действие основано на том, что некоторые опухоли и лейкемические клетки не синтезируют аспарагин и поэтому нуждаются в его поступлении извне, например с пищей. Введение L-аспарагиназы позволяет искусственно ограничить поступление в опухоли указанной аминокислоты и подавляет их рост.
П е н и ц и л л и н а з a (Penicillinasum) - ФеР~ мент, продуцируемый Bacil lus lecheniformis штамм
749/с. Представляет собой белый аморфный гигроскопический порошок, легко растворимый в воде. Активность препарата выражается в ЕД. За ЕД принимают его наименьшее количество, способное инактивировать 10»' моля (около 60 ЕД) бензил-пенициллина в 1 мл фосфатного буфера в течение 1 ч при температуре 37°С. Препарат выпускают в герметически укупоренных флаконах или ампулах по 500 ООО и 1 ООО ООО ЕД. Хранят при комнатной температуре. Применяют при острых аллергических реакциях и анафилактическом шоке, вызванных препаратами группы пенициллина.