Теоретичні питання

1. Реплікація ДНК: біологічне значення, напівконсервативний механізм реплікації.

2. Послідовність етапів та ферменти реплікації ДНК у прокаріотів та еукаріотів.

3. Транскрипція РНК: РНК-полімерази прокаріотів та еукаріотів, сигнали транскрипції (промоторні, ініціаторні та термінаторні ділянки генома).

4. Процесинг – посттранскрипційна модифікація новосинтезованих мРНК.

5. Транспортні тРНК та активація амінокислот. Аміноацил-тРНК-синтетази.

6. Етапи та механізми трансляція (біосинтезу білка) в рибосомах: ініціація, елонгація та термінація.

7. Посттрансляційна модифікація пептидних ланцюгів. Регуляція трансляції.

8. Інгібітори транскрипції та трансляції у прокаріотів та еукаріотів: антибіотики та інтерферони – їх застосування в медицині; дифтерійний токсин.

9. Регуляція експресії генів прокаріотів: регуляторні та структурні ділянки лактозного (Lac-) оперону (регуляторний ген, промотор, оператор).

10. Генні (точкові) мутації: роль у виникненні ензимопатій і спадкових хвороб людини. Біохімічні механізми дії хімічних мутагенів.

Практична робота

Дослід 1. Визначення ДНК за фосфором.

Принцип методу. Метод ґрунтується на отриманні вільних нуклеїнових кислот із наступним визначенням кількості ДНК за фосфором, що утворюється у формі фосфату після мінералізації (спалювання) ДНК. Визначення фосфору проводять фотоколориметрично за реакцією з амонію молібдатом за присутності відновника (аскорбінова кислота). Інтенсивність забарвлення продукту реакції – молібденової сині – є пропорційною кількості фосфору у пробі.

Матеріальне забезпечення: тканина печінки щурів, 1 н розчин натрію гідроксиду (NaOH), 30 % розчин натрію гідроксиду (NaOH), насичений розчин натрію хлориду (NaCl), 20 % розчин ацетатної кислоти (CH₃COOH), етиловий спирт, 5 % розчин ТХАК, концентрована сульфатна кислота (H₂SO₄), 30 % розчин гідрогену пероксиду (Н₂О₂), стандартний розчин калію дигідрогенфосфату (КН₂РО₄) 0,01 мг/мл, 2,5 % розчин амонію молібдату ((NH₄)₂MoO₄), 1 % розчин аскорбінової кислоти, центрифуга, ФЕК, пробірки центрифужні, скляні палички, колба К’єльдаля, конічна колба, льодяна баня, пісочна баня.

Хід роботи.

1. Обробка тканин основою: наважку тканини печінки масою 100 мг нагрівають з 1 мл 1 н розчину натрію гідроксиду у центрифужній пробірці впродовж 15 хв на киплячій водяній бані. Періодично вміст пробірки перемішують скляною паличкою.

2. Послідовне осадження білків і ДНК: пробу поступово охолоджують за кімнатної температури, а потім за температури 0°С (лід). До охолодженого гідролізату додають 0,5 мл насиченого розчину натрію хлориду у 20 % розчині ацетатної кислоти для осадження білків. Осаджений білок видаляють через 5 хв шляхом центрифугування впродовж 5 хв і швидкістю 5 000 об/хв. Центрифугат зливають у центрифужну пробірку (під час охолодження на льоду), додають до нього 6 мл етилового спирту і витримують впродовж 1 год на холоді для повного осадження ДНК. Ще раз центрифугують впродовж 5 хв і швидкістю 5000 об./хв. Осад ДНК відмивають 5 мл 5 % розчину ТХАК.

3. Визначення ДНК за фосфором: осад ДНК кількісно переносять у колбу К’єльдаля, додають 1,5 мл сульфатної концентрованої кислоти і нагрівають (мінералізують) на пісочній бані до повного освітлення розчину. Для прискорення мінералізації до розчину обережно додають декілька крапель 30 % розчину гідрогену пероксиду (по одній краплі). Після закінчення мінералізації рідину з колби К’єльдаля кількісно (вимірюючи об’єм) переносять у колбу Ерленмеєра. Розчин нейтралізують 30 % розчином натрію гідроксиду за допомогою універсального індикатора. Отриманий мінералізат переносять кількісно у мірну колбу на 50 мл і доводять до позначки дистильованою водою. З колби у пробірку відбирають 5 мл розчину, додають 0,5 мл 2,5 % розчину амонію молібдату, 0,5 мл 1 % розчину аскорбінової кислоти і 4 мл дистильованої води. Через 10 хв вимірюють оптичну густину розчину проти води за червоного світлофільтра (довжина хвилі 670 нм) у кюветах завтовшки 5 мм. Вміст фосфору визначають у мікрограмах за калібрувальною кривою.

Для побудови калібрувального графіка використовують стандартні розчини калію дигідрогенфосфату, які містять відповідно 1, 2, 3, 4 мкг фосфору в 1 мл проби. На осі абсцис відкладають значення концентрацій стандартних розчинів, а на осі ординат – відповідні їм значення оптичної густини. Вміст ДНК визначають у мг% за формулою:

С = а × 10,

де: С – вміст ДНК (мг %),

а – концентрація фосфору (мкг/мл),

10 – коефіцієнт перерахунку.

Вміст ДНК у печінці щурів за умов норми становить 25 – 35 мг на 100 г.

Пояснити отриманий результат. Зробити висновок.

Клініко–діагностичне та практичне значення. Визначення кількості ДНК у тканинах пухлини використовують для оцінки прогнозу онкологічних захворювань та можливої індивідуалізації наступного лікування. Крім того, виділяють ДНК з клінічних зразків (біоптати тканин, крапля крові, сперма, слиз жіночих статевих органів, осад сечі, волосся людини, зішкреби епітеліальних клітин тощо) для ланцюгової полімеразної реакції (ЛПР) в діагностиці вірусних та спадкових хвороб людини, ідентифікації особини (ДНК–діагностика) тощо.

При доклінічному експериментальному дослідженні новостворених фармпрепаратів вивчають їх безпосередній вплив як на клітинні органели (ядро, мітохондрії тощо), так і їх компоненти. Тому, в разі отримання субклітинних фракцій клітин, необхідний суворий контроль за їх чистотою і гомогенністю. Однією з головних причин забруднення цитоплазматичних фракцій ядерним матеріалом (а саме, ДНК) є неякісна гомогенізація, що призводить до руйнування ядер. Для оцінки чистоти отриманих цитоплазматичних фракцій у них кількісно визначають ДНК.