Модуль № 3. Молекулярна біологія. Біохімія гормонів і фізіологічних функцій. Змістовий модуль 12. Основи молекулярної біології.

Тема № 1. Катаболізм і біосинтез пуринових і піримідинових нуклеотидів. Визначення кінцевих продуктів їх обміну.

Мета заняття. Засвоїти особливості реакцій синтезу та розпаду пуринових і піримідинових нуклеотидів у нормі та за умов природжених ензимопатій цих процесів. Оволодіти методами визначення кількості сечової кислоти у біологічних рідинах та вміти інтерпретувати отримані дані.

Актуальність теми. Порушення процесів біосинтезу та катаболізму пуринових і піримідинових азотистих основ і нуклеотидів можуть призводити до розвитку синдрому Леша-Ніхана, подагри, оротацидурії. Знання основних метаболітів та ензимів цих процесів є необхідним для діагностики та контролю за лікуванням.

Конкретні завдання.

• Аналізувати послідовність реакцій біосинтезу та катаболізму пуринових нуклеотидів, порушення синтезу сечової кислоти і біохімічні основи розвитку подагри.

• Аналізувати послідовність реакцій біосинтезу та катаболізму піримідинових нуклеотидів.

• Кількісно визначити сечову кислоту в біологічних рідинах, вміти інтерпретувати отримані результати.

Теоретичні питання

1. Біосинтез пуринових нуклеотидів: схема реакцій синтезу ІМФ; утворення АМФ і ГМФ. Регуляція біосинтезу пуринових нуклеотидів за принципом негативного зворотного зв’язку (ретроінгібування).

2. Біосинтез піримідинових нуклеотидів: схема реакцій, регуляція синтезу. оротацидурія.

3. Біосинтез дезоксирибонуклеотидів. Утворення тимідилових нуклеотидів; інгібітори біосинтезу дТМФ як протипухлинні засоби.

4. Катаболізм пуринових нуклеотидів.

5. Спадкові порушення обміну сечової кислоти. Клініко-біохімічна характеристика гіперурикемії, подагри, синдрому Леша-Ніхана.

6. Схема катаболізму піримідинових нуклеотидів.

////////

Практична робота

Дослід 1. Кількісне визначення сечової кислоти в сироватці крові.

Принцип методу. Сечова кислота відновлює фосфатвольфраматний реактив з утворенням сполуки блакитного кольору, оптична густина якої за довжини хвилі 640 нм є пропорційною концентрації сечової кислоти у сироватці крові.

Матеріальне забезпечення: сироватка або плазма крові, 10 % розчин натрію дигідрогенвольфрамат дигідрату, 10 % розчин натрію карбонату, 0,35 М розчин сульфатної кислоти, фосфатвольфраматний реактив (реактив Фоліна), 30 мкМ розчин сечової кислоти, піпетки, пробірки, центрифуга.

Хід роботи: У центрифужну пробірку вміщують 0,5 мл сироватки крові та 4 мл дистильованої води. Вміст пробірки перемішують і додають 0,25 мл 0,35 М розчину сульфатної кислоти та 0,25 мл 10 % розчину натрію дигідрогенвольфрамат дигідрату. Вміст пробірки перемішують і через 5 хв центрифугують впродовж 10 хв зі швидкістю 3 000 об/хв. Відбирають надосадову рідину. Беруть три пробірки і вносять у них реактиви згідно таблиці:

Реактиви	Контрольна проба, мл	Стандартна проба, мл	Дослідна проба, мл
Надосадова рідина	-	-	2
Стандартний р-н сечової кислоти	-	2	-
Вода дистильована	2	-	-
Розчин натрію карбонату	1	1	1
Фосфатвольфраматний реактив	0,5	0,5	0,5

Вміст пробірок перемішують. Через 30 хв визначають оптичну густину стандартної та дослідних проб за довжини хвилі 640 нм (590 – 700 нм, червоний світлофільтр) проти контрольної проби у кюветі завтовшки 10 мм. Блакитне забарвлення залишається стабільним впродовж 30 хв.

Розрахунок вмісту сечової кислоти проводять за формулою:

де: С – вміст сечової кислоти в дослідній пробі, мкмоль/л;

А_досл – оптична густина дослідної проби;

А_конт – оптична густина контрольної проби;

30 – вміст сечової кислоти у стандартному розчині, мкмоль/л;

10 – величина розведення сироватки.

Пояснити отримані результати. Зробити висновок.