Литература / ИПАТОВА ФОСФОГЛИФ про печень

Таблица 9.2.1.

Влияние фосфоглива и эссенциале на синтез РНК в печени крыс, пораженных ССl4

Число животных в эксперименте - 10, из них в контрольной группе - 4, отравленных ССl4 - 6;. ÑÑl4 вводили внутрибрюшинно по 0.1 мл/100 г. Фосфоглив и эссенциале с концентрацией 50 мг/мл (по СФХ) вводили внутрижелудочно по 20 мг/100 г ежедневно в течение 3 суток. Через сутки после последнего введения препаратов вводили [С14]-оротовую кислоту, животных забивали, клетки печени гомогенизировали и центрифугированием разделяли на фракции. Радиоактивность гомогената и фракции полирибосом определяли при помощи жидкостного сцинтилляционного радиометра "Rack-beta" [8].

* - статистически достоверно по отношению к интактным животным; р<0,05.

#- статистически достоверно по отношению к отравленным животным, р<0,05.

Как видно из таблицы 9.2.1, синтез РНК (в основном, мРНК) снижался под действием ССl4 более чем в 3 раза, что может быть связано с нарушением транскрипции и/или активацией нуклеаз под действием токсиканта. Введение фосфоглива или эссенциале достоверно увеличивало синтез суммарной РНК по сравнению с соответствующим показателем у отравленных крыс. Однако уровень синтеза мРНК после введения препаратов не достигал уровня синтеза мРНК в нормальной печени, составляя 63% от контроля. Поскольку суммарная РНК представлена, в основном, рибосомной РНК [8], можно сделать вывод, что синтез рибосомной РНК быстрее восстанавливается под влиянием фосфоглива и эссенциале, чем синтез мРНК.

Включение [С14]-оротовой кислоты в мРНК полирибосом печени крыс, отравленных ССl4, снижалось по сравнению с таковым у интактных животных (табл.9.2.1); снижалось и относительное содержание мРНК, входящей в состав полирибосом (во фракцию частиц >80 S). Эссенциале несколько больше, чем фосфоглив, увеличивал долю новообразованной мРНК, связанную с рибосомами.

Известно, что ССl4 вызывает повреждение мембран ЭР, приводящее к снижению синтеза альбумина [10]. В наших экспериментах показано, что введение фосфоглива крысам после отравления ССl4 приводило к полной нормализации синтеза альбумина. Введение эссенциале не оказывало существенного влияния на этот процесс (табл. 9.2.2).

271

Таблица 9.2.2.

Удельная радиоактивность альбумина (по [С14]-ëейцину) в сыворотке крови крыс после острого отравления ССl4 при лечении фосфогливом и эссенциале.

Количество животных и условия эксперимента - как в подписи к табл. 9.2.1. [С14]-лейцин вводили животным, после чего определяли радиоактивность альбумина сыворотки крови с использованием жидкостного сцинтилляционного радиометра "Rack-beta".

* - статистически достоверно по отношению к интактным животным; р<0,05.

# - статистически достоверно по отношению к отравленным животным; р<0,05.

Как следует из таблицы 9.2.2, синтез альбумина, сниженный в результате повреждения микросомальных мембран при введении ССl4, восстанавливался у животных, леченных фосфогливом.

В экспериментах с введением [Н3]-тимидина нами было показано, что развитие острого токсического гепатита, вызванного введением ССl4, сопровождалось снижением синтеза ДНК в ядрах и митохондриях на 50 и 65 % соответственно. Лечение фосфогливом не оказывало существенного влияния на синтез ядерной ДНК, но в 3 раза усиливало синтез митохондриальной ДНК. Нарушение функций митохондрий при интоксикации ССl4 является, по-видимому, следствием метаболической активации токсиканта непосредственно в этих органеллах [11], поскольку ковалентное связывание метаболитов ССl4 с митохондриальной ДНК в десятки раз выше, чем с ядерной ДНК. Кроме того, синтез митохондриальной ДНК более чувствителен к повреждающему действию ССl4, чем синтез ядерной ДНК [12]. Способность фосфоглива восстанавливать синтез митохондриальной ДНК имеет большое значение для нормализации функционирования клеток и, в частности, митохондрий [13, 14].

Проведенные нами гистологические и гистохимические исследования показали, что через 4 суток после введения ССl4 â

ткани печени развивались морфологические изменения (таблицы

9.2.3 и 9.2.4). В ядрах части гепатоцитов наблюдались явления центрального хроматолиза, вплоть до кариолиза, уменьшалось содержание ДНК. В цитоплазме гистологически измененных клеток наблюдалась белковая и жировая дистрофия, уменьшалось содержание РНК и структурных фосфолипидов (таблица 9.2.3).

272

Таблица 9.2.3

Морфологичекая оценка состояния печени крыс после отравления ССl4 и введения фосфолипидных препаратов (в баллах).*

* состояние ткани печени оценивали гистохимически по интенсивности некроза, макрофагальной и фибробластической реакциям, а также по суммарным дистрофическим изменениям, регистрируемым по 5-балльной шкале: О - отсутствие признака; 1 - незначительные изменения; 2 - умеренно выраженный признак; 3 - выраженный признак; 4 - сильно выраженный признак [9]

В ткани печени были отмечены очаги некрозов, и развитие на месте некрозов грануляционной ткани, на основе которой впоследствии, как известно, развиваются цирротические изменения [15]. Одновременно усиливалась пролиферация фибробластов, приводящая к фиброзу [16].

Репарационные процессы в этот период еще не проявлялись, напротив, митотический индекс и количество двуядерных клеток даже уменьшались по сравнению с контролем (табл. 9.2.4).

Таблица 9.2.4

Митотический индекс и содержание двуядерных клеток (в %) в печени крыс после острого отравления ССl4 с последующим введением фосфолипидных препаратов.

Количество животных и условия эксперимента как в подписи к табл. 9.2.1. Количество гепатоцитов в состоянии митоза и двуядерных клеток рассчитывали на 500 клеток в процентных соотношениях [8, 9].

* - статистически достоверно по отношению к интактным животным; р<0,05.

# - статистически достоверно по отношению к отравленным животным; р<0,05.

Как видно из представленных в таблице 9.2.4 данных, введение животным фосфоглива приводило к увеличению исследованных параметров. Особенно это относится к резкому повышению митотического индекса, что указывает на активацию

273

репарационных процессов в клетках печени.

После введения фосфоглива отмечено прекращение развития некротических процессов, что видно из таблицы 9.2.3. В печени животных, получавших фосфоглив, наблюдалось меньше дистрофических изменений, отсутствует некроз, а также снижены процессы образования грануляционной и фиброзной ткани (фибробластическая реакция). У этой группы животных отмечено повышенное содержание функционально активных крупных гепатоцитов с высоким уровнем РНК и фосфолипидов в цитоплазме по сравнению с не лечеными крысами или животными, получавшими эссенциале.

Несмотря на некоторое снижение общего количества макрофагов в печени животных, получавших фосфоглив, морфологические изменения этих клеток (проявляющиеся в увеличении их размеров, наличии фагоцитарных вакуолей в цитоплазме, ШИК-позитивной зернистости) свидетельствуют о повышении их функциональной активности [9]. Следует отметить, что у животных, получавших эссенциале, лечебный эффект был выражен в меньшей степени. У них слабее проявлялись репаративные процессы, наблюдались более выраженные дистрофические изменения гепатоцитов, у части животных имелись очаговые некрозы.

Активация фосфогливом защитной активности макрофагов у животных отравленных ССl4, проявилась также в индукции перитонеальными макрофагами печени синтеза и секреции TNF, оцениваемых по ИЦ кондиционированной среды макрофагов крыс,

отравленных ССl4. При этом обработка фосфогливом in situ макрофагов здоровых животных практически не влияла на ИЦ при дозах препарата до 0,2 мг/мл (по СФХ), в отличие от эссенциале, увеличивающего ИЦ в 1,5 - 2 раза [9], что подтверждало выше приведенные данные о цитотоксичности эссенциале для макрофагов мышей (рис. 9.1.3). В макрофагах печени крыс, отравленных ССl4, оба фосфолипидных препарата стимулировали синтез и секрецию TNF: до 20-40% ИЦ - при всех концентрациях для эссенциале, начиная с 0,05 мг/мл (по СФХ) и при концентрациях фосфоглива, превышающих 0,1 мг/мл (по СФХ).

Таким образом, способность фосфоглива только при достаточно высоких концентрациях существенно активировать макрофагальную реакцию и индуцировать экспрессию макрофагального TNF, несомненно, относится к его положительным свойствам. Возможно, что умеренная стимуляция синтеза и секреции TNF фосфогливом благотворно влияет на процессы регенерации поврежденной печени.

274

На основании проведенных экспериментов на модели острого токсического гепатита, вызванного отравлением крыс ССl4, можно заключить, что фосфоглив эффективнее, чем эссенциале предотвращает дистрофические изменения гепатоцитов и образование некрозов, а также усиливает репарационные процессы

âклетках.

9.3.Исследование фармакологической активности фосфоглива в экспериментах на животных на модели хронического гепатита, вызванного ССl4.

Исследования эффективности действия фосфоглива в экспериментах с индуцированным хроническим гепатитом были проведены на двух группах животных: (1) с токсическим хроническим гепатитом, вызванным введением ССl4 в течение 2-х недель; (2) с токсическим хроническим гепатитом с элементами цирроза, вызванным введением ССl4 в течение 6 недель [17].

В эксперименте использовали белых беспородных крыс самцов весом 120 - 150г, которым вводили ССl4 два раза в неделю внутрибрюшинно в дозе 0,1 мл/100г. Развитие хронического гепатита у животных подтверждали гистологическими и гистохимическими анализами. Лечение животных фосфогливом и эссенциале проводили, начиная с первого дня введения яда также по двум схемам: (1) в течение 2-х недель; (2) в течение 6 недель. Препараты вводили внутрижелудочно (20 мг СФХ на 100г массы тела) трижды в неделю.

Для характеристики восстановления белоксинтезирующей

функции печени под действием фосфолипидных препаратов в гепатоцитах исследовали синтез мРНК и белка, оцениваемые по включению в них [С14]-оротовой кислоты и [С14]-лейцина соответственно [17, 18].

При отравлении крыс ССl4 по схеме 1 (в течении 2-х недель) в ядрах клеток печени значительно возрастало количество новосинтезированных белков 10,3 ± 1,8 отн.ед. (по включению [С14]-лейцина), в контроле - 4,8 ± 0,72 отн.ед.; 1 относительная единица = имп/мин/мг белка х 103. Это может служить признаком репарационных процессов. В цитозоле (40,8 ± 4,7 отн.ед. против 35,4 ± 3,3 отн.ед. в контроле) и в митохондриях (1,00 ± 0,09 отн.ед. против 1,22 ± 0,17 отн.ед. в контроле) существенных изменений в синтезе белка не наблюдалось. Лечение крыс фосфогливом и эссенциале в течение 2-х недель не оказывало существенного влияния на синтез белка во фракциях клеток печени. Так, включение [С14]-лейцина в белки цитозоля у леченных фосфогливом животных составило 42,4 ± 6,5 отн.ед., а эссенциале -

275

58,6 ± 4,5. Включение в белки ядер клеток печени составило соответственно 10,1 ± 1,7 отн.ед. и 6,5 ± 1,9 отн.ед.

Данные, полученные по включению [С14]-оротовой кислоты в РНК субклеточных фракций клеток печени крыс через две недели после отравления ССl4 показали, что уровень синтеза суммарной РНК в ядрах и содержание новообразованной РНК в цитоплазме клеток печени нелеченных животных повышались по сравнению с контрольными (278,9 ± 21,5 отн.ед по сравнению с 143,9 ± 25,1 5 отн.ед. в ядрах клеток контрольных животных и 169,7 ± 17,9 отн.ед. по сравнению с 106,5 ± 20,8 в цитозоле клеток контрольных животных; 1 отн.ед. = имп/мин/мг РНК х 103). При лечении фосфогливом и эссенциале уровень синтеза мРНК в клетках печени крыс не отличался от синтеза мРНК в печени отравленных, но нелеченных животных. Так, например, уровень синтеза мРНК в клетках печени крыс, леченных фосфогливом, в цитозоле составил 166,9 ± 12,1 отн.ед., а эссенциале - 179,8 ± 20,4 отн.ед.

Таким образом, через две недели после отравления ССl4, уровень синтеза РНК в ядрах и содержание новообразованной РНК в цитоплазме клеток печени не леченых крыс повышались по сравнению с контрольными животными. Это, так же, как и измененный синтез белка, отражает реакцию печени на происходящие в ней некротические процессы. При лечении фосфогливом и эссенциале уровень синтеза мРНК в клетках печени крыс не отличался от синтеза мРНК в печени отравленных, но нелеченных крыс.

На основании приведенных данных можно заключить, что

лечение фосфогливом или эссенциале в течение первых 14 дней (или 2-х недель), которое проводили параллельно с введением крысам ССl4, не оказывало какого-либо влияния на повышенный вследствие протекающих репарационных процессов, уровень синтеза белка и мРНК в гепатоцитах.

Данные гистологического и гистохимического анализа печени крыс при отравлении ССl4, показали, что уже к 14-ому дню в клетках развиваются дистрофические и некротические изменения и, в ответ на них, - воспалительная инфильтрация, пролиферация фибробластов, приводящая к развитию грануляционной ткани. За этот период начинается фибротический процесс, происходит формирование коллагеновых волокон, образование прослоек, состоящих из соединительной ткани. Заметной перестройки ткани печени за 14 дней не отмечено [18]. Однако, увеличение митотического индекса и числа двуядерных и полиплоидных клеток указывают на начало регенерационных процессов в печени. Лечение фосфогливом и эссенциале за этот период (14 дней) не

276

приводит к заметному ослаблению патологического процесса. Морфологические изменения в печени животных этих групп мало отличаются от крыс, не получавших препараты.

Следующим этапом было исследование эффективности действия фосфолипидных препаратов при 45-дневном (6-ти недельном) лечении крыс с экспериментальным хроническим гепатитом с элементами цирроза (схема 2) [17]. Фосфоглив и эссенциале вводили с самого начала эксперимента (со 2-го дня отравления животных ССl4). Именно в таких экспериментах было продемонстрировано в свое время защитное действие эссенциале на мембраны гепатоцитов и предотвращение развития морфологических изменений в тканях печени [19, 20].

В таблице 9.3.1 представлены результаты исследований синтеза белка в субклеточных фракциях клеток печени крыс при длительном отравлении ССl4 с одновременным введением фосфоглива или эссенциале (по схеме 2).

Таблица 9.3.1.

Включение [С14]-ëейцина в белки субклеточных фракций клеток печени крыс с хроническим гепатитом с элементами цирроза после лечения фосфогливом и эссенциале в течение 45 дней.

Количество крыс в каждой группе = 5. ССl4 вводили внутрибрюшинно по 0,1 мл/100 г 2 раза в неделю в течение 45 дней. Фосфоглив и эссенциале с концентрацией 50 мг/мл (по СФХ) вводили внутрижелудочно по 20 мг/100 г 3 раза в неделю в течение всего эксперимента. Меченные предшественник [С14]-лейцин вводили внутрибрюшинно по 50 мкKu/100 г веса за 10 мин. до декапитации животных. Из гомогената печени методом дифференциального центрифугирования получали фракции цитозоля, ядер и митохондрий. Определение радиоактивности проводили при помощи жидкостного сцинтилляционного радиометра "Rackbeta" [17, 18].

* - статистически достоверно по отношению к контролю; р<0,05.

# - статистически достоверно по отношению к нелеченным животным; р<0,05.

Как видно из таблицы 9.3.1, введение как фосфоглива, так и эссенциале препятствует снижению включения [С14]-лейцина в белки субклеточных фракций клеток печени крыс, отравляемых

ÑÑl4.

Результаты включения [С14]-оротовой кислоты в РНК субклеточных фракций клеток печени крыс с экспериментальным

277

хроническим гепатитом с элементами цирроза при лечении фосфолипидными препаратами в течение 45 дней представлены в таблице 9.3.2.

Таблица 9.3.2.

Влияние 45-äневного лечения фосфогливом и эссенциале на включение [С14]- оротовой кислоты в РНК субклеточных фракций клеток печени крыс с хроническим гепатитом с элементами цирроза.

Количество крыс в каждой группе 5. Условия введения ССl4 и фосфолипидных препаратов - как указано в подписи к таблице 9.3.1. [С14]-оротовую кислоту вводили внутрибрюшинно в дозе 50 мкKu/100 г веса за 60 мин. до декапитации животных. Далее гомогенаты печени обрабатывали как указано в подписи к табл. 9.3.1.

* - статистически достоверно по отношению к контролю; р<0,05.

# - статистически достоверно по отношению к нелеченным животным; р<0,05.

Как видно из представленных результатов, фосфоглив и эссенциале полностью восстанавливали биосинтез РНК в цитозоле, сниженный под действием ССl4.

Гистологические и гистохимические исследования

показали, что через 45 дней введения ССl4, по мере замещения очагов некроза соединительной тканью и созревания грануляционной ткани, процесс фиброзообразования усиливался, отмечено образование ложных долек, формируемых соединительнотканными септами, развивалась картина классичесского цирроза.

Введение крысам фосфоглива на фоне длительного отравления ССl4 препятствовало развитию морфологических дистрофических изменений ткани печени (табл. 9.3.3).

Как видно из данных, представленных в таблице 9.3.3, введение эссенциале мало влияло на морфологические изменения в тканях печени; они остались, практически, на том же уровне, что и у животных, не получавших препарат. Введение фосфоглива, напротив, сдерживало диффузное разрастание соединительной ткани и цирротическую перестройку органа. Отмечено существенное ослабление дистрофических изменений, фиброза, развития ложных долек,

278

Таблица 9.3.3.

Морфологические характеристики и митотический индекс печени крыс получавших ССl4 и фосфолипидные препараты в течение 45 дней.

Количество крыс в каждой группе 5. Условия эксперимента - как указано в подписи к таблице 9.3.1. Состояние ткани печени оценивали гистохимически по интенсивности некроза, макрофагальной и фибробластической реакциям, а также по суммарным дистрофическим изменениям, регистрируемым по принятой 5-балльной шкале: О - отсутствие признака; 1 - незначительные изменения; 2 - умеренно выраженный признак; 3 - выраженный признак; 4 - сильно выраженный признак.

воспалительной реакции. В величине митотического индекса достоверных различий между группами животных, получавших и не получавших фосфоглив, не выявлено.

Таким образом, введение фосфоглива в значительной степени способствовало снижению морфологических нарушений ткани печени на индуцированных ССl4 моделях острого и хронического гепатита у крыс. Ослабление нарушений процессов синтеза белка, РНК и ДНК под влиянием фосфоглива наблюдали на моделях острого гепатита [8], а также на модели хронического гепатита с элементами цирроза при его 6-недельном одновременном введении на фоне отравления ССl4 [17, 18]. При меньшей продолжительности лечения фосфогливом он, не влияя на биосинтетические процессы, тем не менее, снижал развивающиеся под влиянием токсиканта морфологические изменения печени.

На основании серии проведенных экспериментов можно сделать следующие выводы:

-результаты гистологического и гистохимического исследования согласуются с результатами биохимических исследований и свидетельствуют о безусловной лечебной

эффективности фосфолипидных препаратов;

-фосфоглив не уступает, а в некоторых случаях обладает более выраженным гепатопротекторным действием, чем эссенциале.

Одним из критериев восстановления нормального

функционирования печени после ее токсического

279

повреждения является восстановление массы тела и обеспечение необходимой скорости ее нарастания.

При анализе влияния фосфоглива и эссенциале на изменение массы тела крыс отмечали естественное увеличение массы тела у контрольных животных на протяжении всего эксперимента. После отравления ССl4 прирост массы тела, начинался только с 15-го дня от начала эксперимента. При лечении эссенциале крысы весили меньше исходных величин до 20-го дня эксперимента, и только затем их вес начинал увеличиваться. Лечение фосфогливом приводило к приросту массы тела, начиная с 14 дня, при этом скорость ее нарастания была близка к скорости увеличения массы тела контрольных животных.

В целом, результаты исследования на экспериментальных животных с моделями гепатитов, индуцированных введением ССl4, показали, что фосфоглив способен восстанавливать клетки печени после острого отравления, а также защищать их в условия длительного повреждения, имитирующего модель хронического гепатита.

Подводя итоги результатов доклинических исследований фармакологической активности фосфоглива необходимо отметить, что:

-фосфоглив и его компоненты в отличие от эссенциале не обладают цитотоксичностью (не ингибирует рост клеток в культуре);

-фосфоглив, в отличие от эссенциале, не повреждает клеточные системы синтеза белка, РНК и ДНК;

-у крыс с острым токсическим гепатитом,

индуцированным введением ССl4, фосфоглив предотвращает дистрофические изменения гепатоцитов и усиливает репарационные процессы в печени, что свидетельствует о перспективности его применения при остром токсическом гепатите в качестве гепатопротектора;

-при хроническом гепатите и при циррозе, вызванном

xpонической интоксикацией ССl4, оба фосфолипидных препарата стимулируют процессы восстановления синтеза белка и мРНК в гепатоцитах, обеспечивают не только восстановление массы тела животных, но и необходимую скорость ее нарастания; результаты гистологического и гистохимического анализа свидетельствуют о специфической гепатопротекторной и антицирротической эффективности препарата фосфоглив.

280