1980-х годах, оказалась важным сигнальным регулятором многих процессов, включая митохондриальное дыхание и образование АФК. NO• с большим сродством, чем кислород, связывается с цитохромоксидазой, ингибируя тем самым митохондриальный аэробный метаболизм и контролируя скорость входа кислорода в дыхательную цепь. Предполагают, что именно благодаря этому свойству NO• при окислительном стрессе в некоторой степени сдерживаются процессы окисления. Кроме того, при интенсивной генерации АФК, NO•, взаимодействуя с радикалами, способствует генерации реакционноспособного пероксинитрита [153]. При тяжелых патологиях (например, сепсис) NO• и АФК, накапливаясь в клетке в больших количествах, инактивируют компоненты митохондриальной дыхательной цепи, блокируя клеточное дыхание и инициируя некроз [154]. Поэтому сепсис в последнее время относят к "митохондриальным болезням", терапия которых может быть связана с воздействием на дыхательные ферменты митохондрий [155].
Липидные радикалы инициируют повреждения не только фосфолипидов мембраны, но и мембранных белков [156, 157], усугубляя тем самым общие мембранные повреждения. При этом наблюдается увеличение микровязкости мембран, изменение их поверхностного заряда, уменьшение гидрофобного объема, увеличение полярности липидной фазы.
Наиболее распространенным пусковым механизмом окислительного повреждения мембранных белков является реакция сульфгидрильных (SH) групп аминокислоты цистеина со
свободными радикалами. При этом образуются радикалы с локализацией неспаренного электрона около атома серы (-S•), которые затем взаимодействуют друг с другом с образованием дисульфидов, либо окисляются кислородом до производных сульфоновой кислоты. Классическим примером такого процесса является связанное с ПОЛ повреждение белков и образование белковых агрегатов в хрусталике глаза, приводящее к его помутнению. Этот процесс играет важную роль в развитии катаракты у человека. Показано также, что ФЛ с окисленными фрагментами арахидоновой кислоты в мембранах фоторецепторных дисков могут взаимодействовать с ε- аминогруппой остатков лизина, модифицируя белки сетчатки [145].
Помимо Cys, окислению подвергаются His, Ser, Pro, Arg, Met, Phe и Tyr [130]. Наряду с окислением этих аминокислотных остатков синглетным кислородом [131, 138], процессы ПОЛ также приводят к появлению окисленных гем-содержащих белков и
141
производных аминокислот. В мембранных белках под действием АФК возможно формирование комплексов "окисленный липид - белок", полимеризация белковых молекул, разрушение боковых групп аминокислот (в первую очередь, содержащих SH-группы). Результатом окисления аминокислот может быть нарушение вторичной и третичной структуры белков, облегчающее дальнейшее окисление аминокислотных остатков, и денатурация белковых молекул, в результате чего нарушаются их функции, в частности, необратимо инактивируются ферменты. Нарушение структуры белков делает их доступными для протеолитических ферментов. К этому добавляется действие специфических протеаз, гидролизующих окисленные белки, для которых окисленные аминокислотные остатки являются маркерами [158].
Считают, что в основе образования комплексов белков с
окисленными липидами лежат, по крайней мере, два механизма: (1) образование ковалентной связи между свободными SH-группами аминокислот и альдегидами или карбоксильными группами окисленных липидов и, (2) образование полимерных продуктов за счет формирования поперечных связей ("сшивок") в белковых молекулах. Эти прочные нерастворимые поперечносшитые соединения не разрушаются ферментами лизосом. Образование молекулярных сшивок способствует дальнейшей агрегации белков.
В последние годы к известным повреждающим эффектам АФК прибавилось их участие в трансдукции сигналов от мембранных рецепторов во многих физиологических процессах [159, 160]. При
ýòîì ÀÔÊ è NO• обычно генерируются при участии таких ферментных систем, как НАДФН-оксидаза и NOS соответственно, обеспечивая систему "редокс-регуляции" [106]. При нарушении этой системы повышенное окислительное действие вызывает повреждения сигнальных белков, с возможными их функциональными изменениями, что вносит свой вклад в повреждение клетки.
4.4.3. Повреждение мембран протеиназами и фосфолипазами.
При многих патологических состояниях в поврежденных клетках происходит активация лизосом с последующим высвобождением локализованных в них ферментов, включая протеиназы и фосфолипазы, которые оказывают повреждающее действие на мембраны [161]. Существует даже точка зрения, что именно высвобождение деструктивных ферментов из лизосом, оказывается тем ключевым механизмом, который запускает цепь последующего некротического повреждения клетки [97]. Так,
142
повреждения лизосомального аппарата печени, с высвобождением гидролаз, показаны в многочисленных исследованиях при интоксикации животных гепатотропными ядами, например, тетрахлорметаном (СС14), галактозамином, афлатоксинами, змеиным ядом, хлорпромазином и др.
Показано, что заражение мышей вирусами мышиного гепатита и осповакцины вызывает активацию ряда лизосомальных гидролаз (γ-глюкуронидазы, кислой протеиназы, ДНКазы и РНКазы) в лизосомальной и надосадочной фракциях гомогената печени животных. Методом электронного микроскопирования было обнаружено разрушение мембран лизосом и воздействие освободившихся гидролаз на митохондрии. Признаки активации лизосомальных ферментов наблюдали и в тканевых культурах при репродукции различных вирусов, в том числе вируса мышиного гепатита. На основании этого полагают, что цитопатическое действие вирусов может быть связано с повреждением лизосомальной мембраны [162]. В целом, по мнению Оnо с соавт. [87], уровень активности лизосомальных ферментов в цитозоле клетки определяет степень повреждения ее мембраны.
Активация лизосомальных ферментов, связанная с разрушающим действием желчных кислот на мембраны лизосом, отмечена при холестазе, что и обуславливает некротические изменения гепатоцитов при этом заболевании [163]. Лабилизаторами лизосом могут быть ионы Са2+, Mg2+, K+, витамины А и Е, фосфолипаза, прогестерон, тестостерон и др. [164], а также продукты ПОЛ [130, 165]. Высвобождение и активация кислых
липаз и фосфолипаз из поврежденных лизосом, приводит, в итоге, к ферментативному гидролизу внутриклеточных компонентов, включая нуклеопротеины, гликоген и содержимое ядра.
Важным звеном в механизме повреждения биологических мембран является гидролиз фосфолипидов, связанный с активацией фосфолипаз, особенно РLA2, отщепляющих жирную кислоту фосфолипидов в sn-2 положении [75] (см. главу 1). Образующиеся при действии эндогенных фосфолипаз А лизоФЛ хорошо растворимы в водной фазе и при концентрациях выше 0,1% от общей суммы ФЛ оказывают мембранолитическое действие. Как уже отмечалось, лизоФЛ, обладая детергентными свойствами, нарушают упорядоченную структуру мембраны, образуя в ней рыхлые участки, вызывают появление "дырок" в мембранах и дальнейший их разрыв. В присутствии лизоФЛ мембраны становятся утолщенными, гидратированными, а их проницаемость для различных веществ резко возрастает. Так, при гипоксии в результате накопления лизоФЛ набухают мембраны митохондрий,
143
нарушается их функциональная активность и способность аккумулировать кальций, снижается синтез макроэнергетических фосфатов. ЛизоФХ препятствует аккумуляции Са2+ саркоплазматическим ретикулумом, и за счет повышения проницаемости происходит высвобождение его из везикул.
Âнастоящее время, в зависимости от нуклеотидной последовательности кодирующих генов, различают как минимум
10 групп РLA2 (I-X), однако пока чаще используется предшествующая классификация, основанная на локализации PLA2
âклетке и ее потребности для проявления каталитической активности в Са2+. Так, различают: (а) фосфолипазу, секретируемую
из клеток или секреторную (sPLA2), c массой 14-18 кД, (б) цитозольную Са2+-зависимую (сPLA2, 85-100 кД) и (в) цитозольную Са2+-независимую (iPLA2, 29-85 кД). Изоформы sPLA2 требуют для проявления активности миллимолярных концентраций Са2+ è íå
проявляют специфичности к отщепляемой жирной кислоте; сPLA2 присутствуют в цитозоле, требуют микромолярного уровня Са2+ для транслокации к мембранным ФЛ и селективны к ФЛ с арахидоновой кислотой. iPLA2 локализованы как в цитозоле, так и
âмембранных фракциях. Активность sPLA2, è ñPLA2 контролируется анионными ФЛ плазматической мембраны [166].
Äëÿ iPLA2 показано несколько вариантов гена, приводящих к экспрессии двух изоформ. Способность всех PLA2 высвобождать арахидоновую кислоту (субстрат для простагландин Н-синтазы) обуславливает их участие в процессах воспаления.
Âпоследние годы показано, что изоформы PLA2 являются
модуляторами клеточных повреждений, вызванных ишемией/реперфузией, оксидантами, лекарствами и токсикантами.
Ðîëü PLA2 в апоптозе и некрозе зависит от изоформы PLA2, типа клетки и характера повреждающего стимула.
Многолетние исследования роли фосфолипазы A2 в повреждении клеток позволили предположить механизм, согласно которому при повреждении увеличивается гидролиз
фосфолипидов с помощью PLA2, что приводит к повышению проницаемости мембран и вызывает клеточный лизис. Правомочность такого механизма была показана с использованием
ингибиторов PLA2 [167]. Однако, в связи с тем, что в то время многочисленные изоформы PLA2 не были известны, использованные ингибиторы не отличались специфичностью. Поэтому ряд прежних положений в последние годы был
пересмотрен [75]. Например, фтор-содержащий ингибитор сPLA2 (и выхода арахидоновой кислоты) не ингибировал sPLA2 è iPLA2 в почечных клетках. Только с использованием комплекса
144
ингибиторов и мониторинга активности PLA2 было показано участие сPLA2 в некротическом повреждении ("онкозе" [168]) этого типа клеток [169]. Полагают, что именно сPLА2, особенно в сочетании с АФК, оказывает существенное мембраноповреждающее действие при некрозе и апоптозе [170]. Считают, что в этих процессах ключевую роль играет повышение уровня цитозольного Са2+ и, соответственно, связывание его с Са2+- липид-связывающим доменом сPLA2, что инициирует транслокацию фермента к внутриклеточным мембранам.
По мнению Сummings c соавт. [75], возможность повреждающего действия PLA2 определяется локализацией и типом мембранных ФЛ, изоформами PLA2 и характером повреждающих стимулов. Так, повреждения, вызываемые Н2Î2 или другими токсикантами, усиливаются благодаря действию сPLA2, и в этом эффекте существенная роль принадлежит ионам Са2+.
Результатом действия PLA2 на липиды биологических мембран является высвобождение ненасыщенных ЖК, в том числе арахидоновой. Последняя является субстратом циклооксигеназы, под действием которой происходит образование в организме эйкозаноидов (простагландинов, тромбоксанов, простациклинов). Под влиянием другого фермента - 5-липоксигеназы, арахидоновая кислота превращается в лейкотриены, которые регулируют сосудистую проницаемость и являются химиоатрактантами нейтрофилов.
Оказалось, что в мембранах действию sPLA2 подвергаются специфические ФЛ. Например, цитолитический эффект
рекомбинантных sPLA2 человека и sPLA2 из змеиного яда по отношению к эритроцитам человека, эритролейкемическим и U937 клеткам возрастает в присутствии экзогенных липосомальных ФЛ (ФХ и ФЭ). [171]. При этом цитолитическое действие sPLA2 человека проявлялось только в присутствии ФЭ. Полагают, что такая специфичность sPLA2 связана с повышением транспорта окисленных ФЛ при повреждении к наружной стороне мембраны, что делает их более доступными для фермента.
Показано, что sPLА2 высвобождается из клеток при ряде воспалительных процессов и обнаруживается в плазме крови во фракциях липопротеинов [172]. Секреторная PLА2 расщепляет в основном окисленные ФЛ и играет тем самым антиоксидантную скэвенджерную роль [173]. Субстратом ее является, в основном, фактор активации тромбоцитов (ФАТ, PAF) и родственные ему по строению соединения фосфолипидной природы, представляющие собой продукты как окислительного, так и частичного энзиматического расщепления ФЛ. Это биологически активные
145
соединения (более 150), чрезвычайно токсичные (LD50 для кролика - 0,005 мг/кг; для собаки - 0,07 мг/кг), вызывающие при внутривенном введении шокоподобное состояние (острый, некупируемый коллапс, бронхоспазм и др.). В норме накоплению этих соединений в организме и препятствует sPLА2.
Изучение роли PLA2 в развитии процессов апоптоза клетки показало, что лизоФХ, образующийся в результате гидролиза ФЛ мембраны iPLA2, является хемотаксическим мессенджером для макрофагов. Было показано, что лизоФХ высвобождается из многих видов апоптозных клеток с помощью Са2+-независимой iPLA2, активированной каспазой-3 [174].
В целом, среди отмеченных выше механизмов повреждения мембран в процессах развивающегося апоптоза или некроза клеток ключевыми являются ПОЛ, увеличение проницаемости фосфолипидного бислоя, активация фосфолипаз и лизосомальных гидролаз. В зависимости от ряда факторов, в том числе и от формы клеточной гибели, один из этих процессов становится основным, индуцирующим развитие остальных.
4.4.4. Механизмы защиты клеток от окислительных повреждений.
При нормальных условиях механизмы антиоксидантной защиты создают устойчивое стационарное состояние с системами, продуцирующими активный кислород. Система энзиматических механизмов защиты клетки от окислительных повреждений включает: супероксиддисмутазу, каталазу, глутатион-зависимые
ферменты [8, 133, 134]. Имеются данные о возможных других механизмах защиты от избыточного перекисного окисления. Так, было показано, что в тромбоцитах присутствие плазмалогенов (в молекулах которых вместо жирных кислот присутствует углеводородная цепь с кетоновой группой), защищает остальные ФЛ от окисления. После их удаления ФЛ активнее подвергаются окислению [175]. В другой работе [176] была показана важная роль пероксидазы и фосфолипазы в репарации окислительно поврежденных фосфолипидов биомембран. Авторы окисляли ФЛ печени крысы как в гомогенате ткани, так и в липосомах, приготовленных из экстрагированных липидов, и анализировали с помощью ВЭЖХ образующиеся гидроперекиси ФХ и ФЭ. При окислении гомогената ткани наблюдали образование окисленных свободных жирных кислот, отсутствующих при окислении липосом, что указывает на действие тканевых фосфолипаз. Если к гомогенату добавляли экзогенный окисленный ФХ, то содержащиеся в нем перекисные группы восстанавливались с
146
образованием окси-ФХ, с последующим гидролизом до свободных жирных оксикислот. То есть, присутствующие в ткани ферменты "очищают" молекулу ФЛ от окисленных жирных кислот.
Основной антиоксидантный фермент, супероксиддисмутаза, катализирует реакцию взаимодействия (дисмутации) двух супероксидных радикалов с образованием перекиси водорода и молекулярного кислорода [133, 134]. В детоксикации LООН участвуют три внутриклеточных глутатион-содержащих фермента - глутатионпероксидаза, ФЛ-пероксид-глутатионпероксидаза и селен-несодержащая глутатион-SH-S-трансфераза тип α, осуществляющие двухэлектронное восстановление LООН [133]. Для гидроперекисей ФЛ (LООН) удаление может включать: (1) последовательное действие пероксид/Са2+-стимулируемой PLA2 и глутатионпероксидазы по схеме "гидролиз - восстановление - репарация", или (2) последовательное действие ФЛ-пероксид- глутатионпероксидаз и фосфолипазы А2, (т.е. "восстановление - гидролиз - репарация"), что в обоих случаях приводит к реацилированию образующихся лизоФЛ. В условиях дисбаланса между эндогенными оксидантами и антиоксидантами возможно избыточное образование активных кислородных метаболитов, которое определяют как окислительный стресс [134, 177].
В последние годы вызывает значительный интерес окислительно-стрессорный сигналинг, который может сопровождать ПОЛ и достигать кульминации при апоптозе. Так показано, что экзоили эндогенные пероксиды могут запускать апоптотический каскад в лейкемических клетках [133]. Судьба
клетки после воздействия на нее оксидантов с вызванными ими повреждениями мембран, может быть двоякой: выживание или гибель через апоптоз или некроз. По мнению Girotti [133], это определяется степенью окислительных повреждений. Во многих работах показано, что животные клетки в ответ на угрожающий уровень оксидантов способны посредством сигналинга продуцировать избыток антиоксидантов и активировать ферментные защитные системы - восстановленный глутатион (GSH), глутатионпероксидазу, каталазу, супероксиддисмутазу, гемоксигеназу-1, ферритин и др.[106, 133, 178].
Показано, что оксидант-индуцированный сигналинг [178] стимулирует экспрессию генов, связанных с цитопротекцией, апоптозом или другими клеточными ответами, причем в этом сигналинге важную роль играет активация некоторых протеинкиназ и фосфолипаз. Так, отмечают особую роль в этих процессах протеинкиназы С, МАРК и гидролаз - фосфолипазы С (PLC) и активируемой Са2+ PLÀ2. Получены данные в пользу того,
147
что некоторые LООН являются ранними интермедиатами в стимуляции этих путей, и что они могут быть "миметиками" эффектов некоторых факторов роста, (например TNF-α), цитокинов или других природных агонистов. Все эти факты вызвали интерес исследователей к оксидантным производным как возможным вторичным мессенджерам [179]. Оксидантная активация PLА2 через высвобождение арахидоновой кислоты инициирует образование эйкозаноидных липидных медиаторов, а также лизоФЛ. Последние могут проявлять прямые эффекты или метаболизироваться до PAF и других эффекторов.
Исследования действия PLА2 на мембранные фосфолипиды показали, что гидролитическая активность этих ферментов возрастала как функция содержания пероксидов ФЛ в мембране. Данный эффект, наблюдавшийся и в экспериментах с липосомами, содержащими окисленные ФЛ, объясняли изменениями упаковки ФЛ, одновременно с увеличением связывания Са2+. Авторы подчеркивают, что скорость гидролиза окисленных ФЛ значительно превышала скорость гидролиза неокисленных ФЛ, что приводило к более быстрому высвобождению окисленных ЖК
[180].Возможен и другой механизм активации, который относится
только к cPLA2, действующей предпочтительно на арахидоноилФЛ, и включает катализируемое протеинкиназой С фосфорилирование фермента и его транслокацию к мембране
[181].В этом механизме мембранные окисленные ФЛ активируют протеинкиназу С, что, в свою очередь, вызывает
фосфорилирование/активацию cPLA2 в клетках, возможно через
активацию МАРК [181, 182]. Этот механизм, в отличие от первого, менее зависим от Са2+, и, следовательно, может включаться при относительно низком уровне ПОЛ, т.е. до того, как начинается существенное накопление внутриклеточного Са2+.
Сопряжение перекисного окисления мембранных фосфолипидов с различными специфическими нарушениями метаболизма в клетке при многих патологических процессах не вызывает сомнений.
4.5.Изменения состава мембранных липидов тканей
при различных патологических процессах.
Значимость мембранных изменений для клетки и организма в целом подтверждается обширным фактологическим материалом об изменении состава ФЛ мембран ряда клеток и тканей при различных патологиях. Не всегда ясно, как эти изменения связаны с патогенезом болезни, являются ли они причиной или, наоборот, проявлением какого-либо из ее последствий. Например, снижение
148
активности фосфолипазы А2 в мозге человека при болезни Альцгеймера рассматривают как необходимые компенсаторные изменения, снижающие скорость потери ФЛ [183]. Наблюдаемое при этом возрастание количества глицерофосфорилхолина и увеличение активности лизофосфолипид-ацилтрансферазы связывают с изменением метаболизма холин-содержащих ФЛ с участием амилоидных пептидов [184]. При изучении липидов мозга у больных шизофренией или их потомков наблюдали снижение уровня фосфомоноэфиров - метаболитов синтеза ФЛ. Их уровень может указывать на риск развития шизофрении [185, 186]. При этом заболевании отмечают также изменение состава полиненасыщенных жирных кислот ФЛ мозга, таких как 20:4, 20:5 и 22:6 [187].
Изучая свойства мембраны нейрона при различных заболеваниях мозга, Haag [188] пришел к выводу, что жирнокислотный состав мембранных ФЛ и активность PLА2 имеют первостепенное значение в развитии дисфункции нейронов.
При экспериментальном атеросклерозе у кроликов, ишемической болезни сердца и циррозе печени у человека показано возрастание отношения холестерин/ФЛ в мембранах эритроцитов, сопровождаемое резким снижением активности Na+, K+-АТФазы и деформируемости эритроцита. При этом у кроликов наблюдались параллельные изменения и в ткани аорты [189, 190]. Впоследствии в мембранах эритроцитов больных ишемической болезнью сердца было обнаружено возрастание доли сфингомиелина, ФС, ФЭ и лизоФХ, при соответствующем
снижении доли ФХ [191]. Снижение уровня ФХ (и в меньшей степени ФЭ и ФИ) наблюдали в тканях сердца экспериментальных животных при его повреждении, вызванном ишемией - реперфузией [192]. При этом было отмечено, что в поврежденном миокарде существенно изменялся процесс "деацилирования - реацилирования" ФЛ.
Существенные изменения ФЛ мембран эритроцитов обнаружены при сахарном диабете. Так, у больных показано присутствие 9-оксилинолевой кислоты, как продукта окисления мембранных ФЛ [193]. У тучных больных с гиперинсулинемией без диабета количество мембранного СМ положительно коррелировало с уровнем инсулина плазмы, что сопровождалось изменением вязкости мембран [194, 195]. Авторы предположили, что мембранный СМ эритроцитов может быть независимым предиктором уровня инсулина.
Еще одним показателем состояния мембран является степень экспонирования ФС на их поверхности (т.е. нарушение
149
мембранной асимметрии) [146]. У тучных больных этот показатель коррелировал с адгезивностью эритроцитов и наличием воспалительных маркеров [196].
При экспериментальном сахарном диабете у крыс установлено снижение уровня ФХ и ФС в мембранах ядер клеток печени, что объясняют участием инсулина в регуляции содержания ядерных ФЛ [197]. Изменения ФЛ были найдены и в бронхо-альвеолярной жидкости больных, в том числе детей, с легочными заболеваниями, что связано с нарушениями покрывающего альвеолы легочного сурфактанта, состоящего в основном из ДПФХ. При этом у взрослых больных с астмой наблюдали снижение этого ФЛ, коррелирующее с ослаблением легочной функции [198], а у детей с легочными заболеваниями, включая астму и инфекционные заболевания, было обнаружено увеличение уровня (концентрации) ФЛ, с накоплением агрегатов, что связывают с выходом разрушенного мембранного материала из воспаленных клеток [199].
При умеренном потреблении алкоголя в мембранах ряда клеток наблюдали возрастание показателей окислительного стресса [200], а при алкогольной абстиненции - снижение интенсивности и времени релаксации ЯМР сигнала ФЛ белого вещества мозга, расцениваемое как признак снижения концентрации и подвижности ФЛ [201]. В ткани метастазирующей кишечной карциномы крыс наблюдали возрастание уровня ФЭ [202], а в клетках слизистой кишечника человека при пептической язве с инфицированием Helicobacter i., наоборот, было показано, снижение уровня этого ФЛ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ К ГЛАВЕ IV
1.Maeshima Y., Makino H. Molecular mechanism of cell injury. Contrib Nephrol. 2003, 139, 32-43.
2.Paschen W., Doutheil J. Disturbance of endoplasmic reticulum functions: a key mechanism underlying cell damage? Acta Neurochir Suppl. 1999, 73, 1-5.
3.Куценко С. А. Основы токсикологии. Ñ-Ï. 2002.
4.Takemura G., Fujiwara H. Role of apoptosis in remodeling after myocardial infarction. Pharmacol Ther. 2004, 104, 1-16.
5.Arakawa N., Nakamura M., Endo H., Sugawara S., Suzuki T., Hiramori K. Brain natriuretic peptide and cardiac rupture after acute myocardial infarction. Intern Med. 2001, 40, 232-236.
6.Тарусов Б.Н. Физико-химические механизмы биологического действия ионизирующих излучений. Усп совр биол. 1957, 44, 171185.
7.Эммануэль Н.М., Липчина Л.П. Лейкоз у мышей и
150