способствующие фрагментации хроматина.
Накапливающиеся свободные жирные кислоты и ионы Ca2+ активируют PLA2, что приводит к гидролизу ФЛ, и деструкция приобретает автокаталитический характер [105]. Лавинообразный каскад взаимно усиливающих друг друга деструктивных процессов делает повреждения необратимыми, приводя к аутолизу клетки, разрыву мембраны, с высвобождением внутриклеточного содержимого. При этом из ФЛ разрушенных внутриклеточных мембран возможно образование миелиновых структур, которые могут либо поглощаться другими клетками, либо подвергаться дальнейшей деградации с образованием свободных жирных кислот. Последние, образуя соли с Са2+, способствуют дальнейшей некротизации ткани. После гибели клетки продолжается деградация ее компонентов. Высвобождение вместе с содержимым клетки в межклеточную среду ее ферментов и последующее обнаружение их в крови служит важным клиническим признаком гибели клеток (в частности при инфаркте миокарда или заболеваниях печени).
Неспособность клеточных мембран поддерживать низкую концентрацию Са2+ в цитоплазме и регуляцию гомеостаза митохондриального Ca2+ Brookes с соавт. [72] считают существенным фактором в развитии необратимых повреждений, лежащим в основе механизма некроза клеток при целом ряде патологий (ишемия, аутоиммунные процессы и т. д.), а также цитотоксического действия многих химических соединений.
Высокие концентрации Ca2+ в цитоплазме действуют на
митохондрии, способствуя раскрытию в них (как и при апоптозе) транзитных пор (РТР), особенно в условиях окислительного стресса [59-63, 109]. При выраженном образовании РТР нарушается осмотический баланс между матриксом и межмембранным пространством митохондрий, вода начинает поступать в матрикс, вызывая его набухание и разрыв наружной митохондриальной мембраны. В поврежденной митохондрии генерация АТФ резко снижается. Открытие РТР приводит также к снижению митохондриального трансмембранного потенциала [110]. Это сочетается с деполяризацией плазматической мембраны, приводя к деградации Na+,Ê+-АТФазы и еще больше усиливая повреждение мембраны [59, 111]. Считают, что открытие РTP является важным фактором в патогенезе некроза после ишемии и реперфузии [109].
Раскрытие пор и увеличение проницаемости митохондриальных мембран контролируется некоторыми (специфичными) вторичными мессенджерами и проапоптозными белками, включая семейство Bcl-2. В обычной клетке белок BNIP3,
131
относящийся к этому семейству, слабо ассоциирован с митохондриальной мембраной, но при активации повреждающих стимулов он полностью интегрируется в наружную мембрану митохондрий, увеличивая ее проницаемость, способствуя дисфункции митохондрий и участвуя, таким образом, в некротической гибели клетки. Данный механизм может иметь важное значение, в частности, при гипоксическом повреждении клетки, вызывающем экспрессию BNIP3 [112].
Реперфузия ишемизированных гепатоцитов гликолитическим субстратом, способствующая восстановлению уровня АТФ, предотвращает некроз даже после открытия РТР, и вместо некроза включается индуцированный каспазами апоптоз [109]. То есть, одним из главных факторов, определяющих "выбор" между некрозом и апоптозом клетки, оказывается уровень внутриклеточного АТФ. Повышенный расход АТФ в поврежденной клетке может быть вызван необходимостью ресинтеза НАД+ в связи с активацией требующих НАД+ ферментов [112]. В то же время такая точка зрения противоречит данным Yu с совт. [113], показавшим, что расход НАД+ служит только сигналом для транслокации в цитозоль межмембранного митохондриального белка AIF (apoptos inducing factor), активирующего нуклеазы [46], и расход АТФ определяется энергетическими потребностями клетки.
Увеличение проницаемости митохондриальной мембраны из-за открытия транзитных пор с последующим разрушением митохондрий и ингибированием дыхания показано в случае цитолитического гепатита [114, 115].
Âцелом, всеми авторами отмечается, что резко выраженная потеря АТФ, особенно сопряженная с открытием РТР [62], приводит к некротической гибели клетки. Это, как считают, вызвано влиянием возникающего дефицита АТФ на многие системы клетки, в частности:
- снижается активность мембранного энергозависимого натриевого насоса, что приводит к внутриклеточной осмотической перегрузке;
- изменяется энергетический метаболизм в клетке. Повышенная скорость аэробного гликолиза приводит к
быстрому истощению запаса гликогена и снижению внутриклеточного рН. Развивающийся ацидоз, в свою очередь, способствует выходу в цитоплазму ферментов, локализованных в лизосомах (катепсины, нуклеазы, гиалуронидаза, кислая фосфатаза
èдр.), которые способны гидролизовать собственные компоненты клетки, включая клеточные мембраны.
Âцелом, при любых повреждениях клетки судьба митохондрий во многом определяет возможность ее выживания, а также путь
132
гибели (апоптоз или некроз) [59]. Обеспечивая клетку энергией (синтез АТФ), митохондрии являются также и источником образующихся в этих процессах АФК, которые в случае гиперпродукции и нарушения гомеостаза в клетке, становятся источником ее повреждения и гибели. В нормальных условиях допустимый уровень АФК в митохондриях поддерживается развитой системой защиты, включающей цитохромоксидазу, супероксиддисмутазу и глутатионпероксидазу и др. Если же концентрация АФК продолжает нарастать, происходит открытие РТР, с выходом в цитоплазму АФК и цитохрома ñ, что сдерживает дальнейшую генерацию АФК. Продолжение открытия РТР при избытке АФК вызывает гибель митохондрий (называемую "митоптозом"), которая, за счет выхода митохондриальных белков (цитохрома ñ, AIF) может привести к апоптозу, или (при нехватке АТФ) к некрозу [46].
Гибель клеток, вызванную ослаблением функционирования митохондрий и дефицитом АТФ, считают существенным фактором в развитии многих патологий (атеросклероз, диабет, нейродегенеративные заболевания, старение) [116].
4.3.2. Обратимость повреждений.
Структурные и функциональные изменения митохондрий могут быть обратимыми, например, при нерезко выраженной радиации, включающей ионизирующее и УФ-излучение, особенно в тех случаях, когда обратимость изменений свойственна и другим субклеточным структурам, таким, как плазматическая мембрана и
ЭР [117]. Обратимым считают само явление формирования транзитных пор [59, 118], однако конкретные условия их возможного закрытия не описаны. In vitro при гиперосмотическом воздействии, вызывающем фрагментацию митохондриальной сети, показана обратимость изменений митохондрий: через 1 час после замены гипертонической среды на изотоническую наблюдалось восстановление структуры [119].
Возможность обратимости повреждений, особенно на начальных этапах, показана и для цельных клеток. Первая, обратимая стадия - это неспецифическая реакция, свойственная любому раздражению. Она характеризуется увеличением проницаемости клеточных мембран для ионов, в частности, Са2+, с последующей активацией внутриклеточных гидролаз. При этом относительно мягкие устойчивые повреждения мембран, проявляющиеся в небольшом изменении состава липидов и микровязкости фосфолипидного бислоя, приводят не к гибели клетки, а к развитию метаболических нарушений. Например,
133
возрастание доли холестерина в мембранах при нарушениях липид-транспортной системы, связанных с атеросклерозом и/или старением, или частично компенсируемые процессы ПОЛ при сахарным диабете [120]. Патологии, связанные с такими нарушениями, могут протекать длительное время, вызывая хроническое накопление дефектов многих клеточных функций. В то же время, по прекращению действия повреждающих факторов (ишемии, радиации, токсического воздействия и др.) ограниченное (локальное) повреждение мембраны может быть восстановлено.
Так, обратимость изменений в клетках наблюдали при ишемии миокарда с последующей реперфузией [121]. При относительно небольшой ишемии возможна адаптация клетки, сопровождающаяся некоторыми изменениями соотношения мембранных липидов (насыщенных и ненасыщенных жирных кислот, индивидуальных классов ФЛ, холестерина) и связанными с этим небольшими постепенными повреждениями. Резкая же или длительная ишемия приводит уже к глубокому повреждению клетки и развитию некроза или апоптоза. Отмечают два фактора, обуславливающие необратимость клеточного повреждения при ишемии: (1) митохондриальная дисфункция клетки с резким дефицитом АТФ и (2) развитие выраженных повреждений функций мембран. При наличии этих факторов возникшее повреждение в оставшихся клетках обостряется после реперфузии еще больше, вызывая, так называемые, "ишемическиереперфузионные" повреждения.
До сих пор нет универсальной оценки, характеризующей
"пограничный" статус перехода поврежденной клетки из обратимого состояния к необратимому. Вероятно, это и невозможно из-за совокупности множественного влияния индивидуальных клеточных факторов.
Lieberthal с соавт. [122] провели расчет зависимости обратимости или необратимости повреждения клетки (ухода в апоптоз или некроз) от ее обеспеченности АТФ. По их данным, апоптоз развивается при дефиците АТФ в 25-70 % от его нормального уровня, а некроз - в случае превышения этого порога. Следовательно, если дефицит АТФ меньше ~ 20%, то успевшие развиться изменения, включая первичные повреждения мембраны, являются обратимыми и у клетки есть "шанс" выжить. Важную роль в нормализации функционирования клетки играют, так называемые, "белки теплового шока" (heat shock proteins, hsp), которые способствуют оптимальному фолдингу белков и восстановлению их после повреждений [46, 123].
Взаимосвязь рассмотренных выше биохимических процессов,
134
Рис. 4.3.1. Биохимические процессы при некротическом повреждении клетки
приводящих к некрозу клетки можно представить схемой (Рис.4.3.1). [19]. Таким образом, в биохимическом механизме некротической гибели клетки ключевую роль играют три типа сопряженных процессов: (1) резкое повышение концентрации ионов Са2+ в цитозоле; (2) разобщение дыхания и окислительного фосфорилирования в митохондриях (с истощением клеточного АТФ); (3) возрастание проницаемости плазматической мембраны и ее повреждение. Эти деструктивные процессы, каждый из которых усиливается генерацией АФК и развивающимся окислительным стрессом, протекают одновременно и взаимосвязано [3, 8, 105-107].
Торможение или блокирование на определенных стадиях этих деструктивных процессов, особенно в сочетании с направленной репарацией поврежденных мембран, и является основой терапевтического воздействия на патологические процессы, сопровождающиеся развитием некрозов.
В последние годы показана возможность смешанных путей клеточной смерти, а именно, некротическая гибель клеток может содержать некоторые элементы апоптоза (но не наоборот) [100]. Например, необратимая гибель клеток почечной ткани, индуцированная ишемией, токсинами или острой почечной недостаточностью происходит путем апоптоза и некроза одновременно [20]. Относительный вклад этих двух механизмов в гибель клеток зависит от их типа и степени повреждения [124, 125]. По мнению Zeiss [100], существует, так называемый, "апоптозонекрозный континуум", определяемый перекрестными взаимодействиями (cross-talk) между реакциями гибели клетки и
135
сохранения гомеостаза. Эти процессы могут сосуществовать как в ткани, так и в одной клетке. На культуре клеток было показано, что внесение глюкозы как энергетического субстрата сдвигает баланс в сторону апоптоза [26]. Появляется все больше данных, свидетельствующих об участии в процессах некроза в клетке не только митохондриальных пор (РТР), но и некоторых каспаз (в частности каспазы-1) [126], или "Fas-ассоциированного домена смерти" (FADD) [127]. На культуре клеток 293Т показан "неапоптотический" тип программируемой клеточной смерти - с частично апоптозной морфологией, но с набуханием митохондрий и без фрагментации ядра - названный авторами "параптозом" [128]. Для гибели нейронов также отмечены "некрозо-подобные фенотипы" (апонекроз) [14]. В исследованиях ex vivo на ацинарных клетках поджелудочной железы было показано, что мягкая (умеренная) форма панкреатита сопряжена преимущественно с апоптозом, а при остром выраженном панкреатите наблюдался некроз с очень малым включением апоптозных клеток [19].
Таким образом, разнообразные внешние и внутренние повреждающие факторы инициируют в клетке ответ в виде апоптоза и/или некроза - двух форм клеточной гибели, различающихся по клинико-морфологическим и биохимическим признакам. Представления о первичности мембранных нарушений при действии на клетку повреждающих факторов, характерные для 70-80-х г.г. прошлого века, благодаря полученным многочисленным доказательствам, несколько изменились. Для
апоптоза характерно изменение функций мембран на заключительных этапах гибели клетки, а для некроза этот этап является одним из ключевых, определяющих обратимость развивающихся повреждений.
4.4. Повреждения мембран как обратимый этап некроза.
4.4.1.Общие биохимические механизмы повреждения мембраны.
Несмотря на многообразие факторов, вызывающих некротическое повреждение клетки, можно выделить несколько основных механизмов нарушения структуры и функции мембран клеток и их ферментных систем. К числу наиболее важных первичных процессов относят [105]: (1) ПОЛ, сопровождающееся окислительной модификацией мембранных белков и изменением сигнальных процессов в клетке; (2) активация лизосомальных гидролаз и эндогенных фосфолипаз. Эти деструктивные процессы в клетке сопряжены с (3) детергентными эффектами
136
накапливающихся продуктов расщепления фосфолипидов (свободных жирных кислот, лизофосфолипидов); (4) поврежденим цитоскелета и "отсоединением" его от клеточной мембраны, что делает мембрану более доступной к растяжению и разрыву.
В той или иной степени каждый из указанных механизмов является универсальным и играет роль в патогенезе многих заболеваний. Возможны воздействия и ряда иных, более специфических, мембрано-повреждающих факторов, направленных непосредственно на белковые компоненты (токсическое действие ионов тяжелых металлов, бактериальных токсинов, некоторых ядов и др.), что подробно описано в литературе [1, 3].
4.4.2. Свободно-ðадикальное окисление липидов.
Свободнорадикальное или перекисное окисление липидов, благодаря возросшему интересу к его многочисленным эффектам, стало фактически отдельной областью биохимии, которой посвящено огромное количество литературы [129 - 137], начиная со ставшей уже классической книги А.И. Арчакова и Ю.А. Владимирова "Перекисное окисление липидов в биологических мембранах" [130]. В настоящем обзоре предполагается рассмотреть лишь мембранно-повреждающее действие ПОЛ, в основном за счет образующихся перекисных липидных соединений (обозначаемых в литературе как LOOH) и других родственных им интермедиатов (промежуточных соединений реакций ПОЛ).
В инициировании процессов свободно-радикального
перекисного окисления ненасыщенных жирных кислот фосфолипидов ведущую роль играют активные формы молекулярного кислорода. К их числу относятся синглетный кислород (1Î2), супероксидные радикалы (Î2•- ), перекись водорода Н2Î2 и наиболее реакционно активные гидроксильные (ОН•) и пероксидные (НО•2) радикалы.
Чрезвычайно реакционноспособный синглетный кислород (1Î2) представляет собой электронно-возбужденную форму молекулярного кислорода [138]. В отличие от обычной молекулы О2, в которой два неспаренных электрона с параллельными спинами находятся на разрыхляющих орбиталях (обозначаемых как π*x,z), в синглетном кислороде происходит изменение состояния одного из электронов путем его перехода на другую орбиталь с одновременной инверсией спина (т.е. направления вращения). Образование синглетного кислорода, обладающего диамагнитными и выраженными электронно-акцепторными свойствами, сопряжено с поглощением свободной энергии (400 КДж/моль).
137
В организме человека и животных 1Î2 образуется как побочный продукт при таких реакциях, как распад органических гидроперекисей, дисмутация супероксидных анионов и пероксидных радикалов, взаимодействиях Н2Î2 ñ -ОСl, катализируемых хлорпероксидазой. Показано образование 1Î2 при перекисном окислении микросомальных липидов, реакциях биосинтеза простагландинов, и др. [131]. Например, при разложении Н2Î2 каталазой 0,5% образующегося кислорода находится в синглетном состоянии. Из-за высокой реакционной способности время жизни 1Î2 в мембранах чрезвычайно короткое (порядка 10-6 сек), поэтому его концентрация в мембранах не превышает 10-6 М [134]. Синглетный кислород считают одним из самых сильных оксидантов, цитотоксическое действие которого связано, прежде всего, с окислительной модификацией мембранных белков за счет окисления Trp, His, Tyr, Met и Cys, с дальнейшей инициацией других окислительных процессов. Следствием такого окисления оказывается инактивация белков и их агрегация с образованием поперечных сшивок [138-140]. Показано, что действие 1Î2 разобщает сигнальные процессы в клетке, и вызывает защитный клеточный ответ, включающий активацию МАРК [141]. Несмотря на то, что некоторые исследователи не считают определяющим вклад эндогенного 1Î2 в общее цитотоксическое действие АФК [134, 142], в большинстве работ самых последних лет отмечается значение синглетного кислорода как мощного фактора повреждения мембранных белков [138, 139].
Ключевыми в действии АФК являются также первичные,
супероксидные радикалы (О2•-), которые образуются при участии электрон-транспортных ферментных систем в митохондриях особенно интенсивно при "кислородном взрыве", связанном с активацией НАДФН-оксидазы [143]. Скорость генерации (О2•-) может увеличиваться при попадании в клетки таких соединений, как бипиридилы или антрациклины, которые принимают или отдают электроны на уровне флавиновых или хиноновых переносчиков и затем аутоокисляются, повышая выход кислородного радикала [133]. Из них образуются вторичные свободные радикалы - радикалы гидроксила (ОН•), пероксида (НО2•) и радикалы липидов - как продукты реакций супероксида (О2•-), под действием присутствующих в организме ионов металлов переменной валентности, в первую очередь Fe2+ [8, 106, 130, 134, 137]. Супероксид (О2•-) реагирует крайне быстро с другим, слабо окисляющимся радикалом, оксидом азота (NO•), образуя пероксинитрит (ОNOО) или пероксинитрокислоту (ОNOОН) - сильный оксидант и нитрирующий агент [144]. Все эти продукты
138
оказывают разрушительное действие на клеточные структуры, инициируя реакции цепного окисления фосфолипидов мембран. Инициирование цепной реакции начинается с внедрения в мембрану свободного радикала (в первую очередь ОН•), способного из-за небольшого размера проникать в толщу гидрофобного липидного слоя и вступать в химическое взаимодействие с полиненасыщенными жирными кислотами ФЛ, разрывая С-Н-связи около соседнего с двойной связью атома углерода (-СН=СН-CН2-), с последующим образованием липидных радикалов, инициирующих, в свою очередь, следующую реакцию. Этот, подробно описанный в литературе процесс, приводит к образованию широкого спектра продуктов деградации ФЛ, вызывающих изменения свойств биомембран [8, 130, 134].
Âпроцессе окисления может происходить, в частности, образование мембраноактивных лизоФЛ. Гидрооксиды ФЛ и лизоФЛ, обладая выраженными детергентными свойствами, способны вызвать дезорганизацию липидного бислоя, проявляющуюся в увеличении толщины мембраны, фрагментации мембранных везикул, вытеснении мембранных белков из гидрофобной зоны бислоя в поверхностную полярную область.
Âбиомембранах цепь окисления может состоять из десяти и более звеньев. В конце концов, цепь обрывается в результате взаимодействия свободных радикалов с антиоксидантами, ионами металлов переменной валентности (например, Fe2+) или друг с другом [8, 130, 137].
Окислению ФЛ способствует более высокая (в 7-8 раз)
растворимость молекулярного кислорода в липидной фазе, чем в воде и гидрофильных участках клетки. Для развития процесса важна степень насыщенности тканей кислородом, повышающая количество радикалов в виде вторичных активных форм кислорода. Поэтому хорошо снабжаемые кровью и насыщенные кислородом ткани (легкие, сердце, головной мозг) являются более чувствительными к повреждающему действию активаторов ПОЛ.
Окислению подвержены в первую очередь ненасыщенные ФЛ, содержащие в sn-2 положении полиненасыщенные жирные кислоты - арахидоновую, линолевую и др., являющиеся основной мишенью ПОЛ. Например, при индукции ПОЛ в мембранах ЭР происходит избирательная модификация полиеновых жирных кислот ФЭ. Содержание ФХ также снижается и увеличивается концентрация более полярных липидов, с насыщенными жирными кислотами - лизоФХ и СМ. При этом уровень арахидоновой кислоты снижается более чем вдвое, а докозогексаеновая кислота (22:6) исчезает почти полностью [145].
139
Известно, что ФЛ распределены в мембране асимметрично с преимущественной локализацией аминосодержащих липидов с полиненасыщенными ЖК во внутреннем монослое [146] (см. главу 3). Именно эти ФЛ наиболее подвержены перекисному окислению, приводящему в итоге к еще большей асимметрии мембраны и изменению ее свойств, сопряженных с жидкостностью и проницаемостью, что и наблюдается при патологических процессах различной этиологии. В процесс вовлекаются ФЛ, как формирующие бислой, так и входящие в микроокружение мембранных белков. Рецепторы макрофагов могут "узнавать" мембраны клеток, поврежденных ПОЛ за счет присутствия на внешнем монослое окисленных фосфолипидов и ФС, транслоцированного из внутренней области мембраны (см. апоптоз) [83]. ФЛ, локализованные в мембранных рафтах, менее подвержены ПОЛ из-за низкого содержания в них ненасыщенных жирных кислот.
Перекисному окислению подвергается также и мембранный холестерин, при этом образуются 5α-, 6α-, 7α- и 6β-гидроперекиси холестерина [147].
В нормальных условиях из-за строгого контроля специфических регуляторных систем клетки скорость ПОЛ невелика. Увеличенное образование свободных радикалов в организме и связанное с этим усиление процессов ПОЛ (окислительный стресс) сопровождается рядом нарушений свойств биологических мембран и функционирования клетки в целом [101, 148 - 150].
Непосредственным результатом ПОЛ является повышение
проницаемости мембраны, что может быть обусловлено: (1) изменением заряда на поверхности раздела мембранаоколомембранная среда; (2) изменением конформации мембранных липопротеиновых комплексов; (3) появлением гидрофильных участков в гидрофобном слое мембраны. Образование таких гидрофильных сайтов может привести к формированию водных пор, резко нарушить стабильность слоя мембраны, вплоть до ее полного разрыва [130, 137 14]. Результатом ПОЛ оказывается и уменьшение стабильности липидного бислоя, что может привести, в свою очередь, к изменению электрических свойств мембраны, и, как следствие - потере мембраной ее барьерных функций.
Особое внимание в литературе последних лет уделяется действию NO• и генерирующих его NO-синтаз (особенно эндотелиальной NO-синтазы - eNOS) [151-153], в частности, роли NO• в свободнорадикальных процессах. Эта, проникающая через мембрану молекула, обнаруженная в биологических системах в
140