Высказывались предположения, что ФК может под действием этих фосфолипаз генерироваться во внешнем монослое плазматической мембраны при воспалительном ответе клеток организма [58, 59], когда sPLA2 становится провоспалительным фактором [60]. Показана высокая активность такой реакции при септическом шоке, при котором уровень sPLA2 в крови человека возрастает в сто раз, достигая величины порядка 1мкг/мл, достаточной для гидролиза клеточных мембран. По-видимому, в образовании ФК на наружной поверхности мембран участвует и фосфолипаза D. В сыворотке крови была обнаружена специфичная к гликозилфосфатидилинозиту фосфолипаза D, способствующая генерации ФК в несвойственном этому ФЛ поверхностном монослое мембран клеток, что может in vivo стимулировать воспалительный ответ.
Обнаружено, что ФК присутствует в микровезикулах, образующихся при "шединге" мембран (явлении "отпочковывания" и отделения от мембраны участков ее наружного слоя), возможно, участвуя в этом процессе. На это указывает образование лизофосфатидной кислоты (лизоФК) при действии sPLA2 человека на эти микровезикулы [61]. Установлено, что лизоФК присутствует в артритной синовиальной жидкости, где высока активность sPLA2.
ФК связана с некоторыми процессами в аппарате Гольджи [62]. Предполагают, что ФК может быть включена в процессы передачи сигнала, хотя непосредственная ее роль как липидной сигнальной молекулы не доказана [63 - 65]. Более определенной в функциональном отношении является роль ФК как
предшественника лизоФК, которая играет существенную роль в процессах передачи клеточных сигналов. ФК и лизоФК оказывают противоположные эффекты на кривизну мембраны и процесс слияния мембран при образовании везикул, что связывают с активностью лизофосфатидил-ацилтрансферазы [66]. Замена конусообразного липида (ФК) на липид с конформацией перевернутого конуса (лизоФК) усиливает отрицательную мембранную кривизну, способствующую слиянию мембран.
Фосфоинозитиды (ФИ). Известно, что инозит-содержащие ФЛ играют роль как в поверхностном связывании белков, так и в генерации важных сигнальных молекул. Будучи полианионами, фосфоинозитиды за счет анионного заряда высокой плотности эффективны в электростатических липид-белковых взаимодействиях даже при относительно низком содержании их в мембране [66].
Существенным является и специфическое взаимодействие ФИ с белковыми доменами, например, с так называемыми РН-доменами.
91
Впервые они были идентифицированы в плекстрине как повторяющийся белковый модуль, насчитывающий около 120 аминокислотных остатков, после чего были обнаружены также более чем у 100 эукариотических белков. Эти домены, называемые плекстрин-гомологичными, обладают сходной третичной структурой и могут служить медиаторами в белок-липидных или белок-белковых взаимодействиях. Лигандами для них являются различные фосфорилированные ФИ. Большинство белков, содержащих РН-домены, требуют для выполнения своих функций присоединения к мембране, которое и осуществляют с помощью этих участков. Примером белков, взаимодействующих с мембраной посредством РН-доменов, является фосфолипаза С-δ1 [67]. Кроме того, выявлен ряд других белковых доменов, узнающих различные фосфорилированные ФИ, в частности, в недавно открытом функционально важном ферменте фосфоинозитид-3-киназе [68].
ФИ участвуют в поддержании структуры GPI-заякоренных белков, имеются также данные о их роли в функционировании белков цитоскелета [69].
Наиболее важную роль ФИ играет в мембранах, особенно в плазматической мембране клеток. Это связано с участием ФИ в процессах трансдукции сигнала, в ходе которой внутренние структуры клетки "узнают" о каких-либо внеклеточных событиях - например, о присоединении белков, гормонов, и др. ФИ, присутствуя в мембране в минорных количествах, подвержен активному метаболизму, строго контролируемому и реагирующему на внеклеточные воздействия. Механизмам участия ФИ в
процессах передачи сигнала посвящены многие обзоры [70, 71]. Кратко, ФИ подвергается последовательному фосфорилированию до ФИ-4,5-дифосфата (с участием АТФ и ряда киназ) и активации (в ответ на внешние стимулы - включая антигены) фосфолипазы С, под действием которой образуется диглицерид и инозит- трифосфат-1,4,5. Каждое из этих соединений может служить вторичным мессенджером, "включающим" каскад биологически важных реакций. Например, диглицерид активирует РК С, а инозит-трифосфат-1,4,5 индуцирует выход внутриклеточного Са2+.
ФИ играют существенную роль в различных клеточных функциях. Их внутриклеточный уровень строго регулируется специфическими ФИ киназами, фосфатазами и фосфолипазами. Сам фосфатидилинозит рассматривается как предшественник других ФИ (поли-ФИ), образование которых происходит с помощью последовательного фосфорилирования ФИ специфическими киназами.
Метаболизм ФИ в клетке строго контролируется. Они
92
действуют либо как предшественники вторичных мессенджеров, таких как инозит-трифосфат-1,4,5 и диглицерид, или непосредственно - путем взаимодействия с белками и пространственно-временным координированием путей внеклеточной передачи сигнала ("сигналинга") [2, 72].
Показано участие ФИ в ряде физиологических процессов, включая клеточную пролиферацию, регуляцию передвижения с участием белков цитоскелета, перемещение внутриклеточных везикул, клеточный метаболизм и, наконец, гибель клетки. Поэтому дисфункции в контроле их уровня часто ведут к патологиям [71, 73].
ФИ-3,4,5-трифосфат и ФИ-3,4-дифосфат представляют собой минорные ФИ, быстро продуцируемые в ответ на различные стимуляции клетки. ФИ-3,4,5-трифосфат является сигнальной молекулой, способной взаимодействовать с высоким сродством с некоторыми белками, содержащими РН-домен. Показано, что ЛНП крови способны стимулировать катаболизм ФИ с генерацией вторичных мессенджеров, диглицерида и инозит-1,4,5-трифосфата, и последующей активацией протеинкиназы С и высвобождением Са2+ из внутриклеточного депо [74, 75].
Фосфатидилглицерин (ФГ) и кардиолипин (КЛ). ФГ - главный компонент ФЛ бактериальных мембран, но минорный ФЛ в тканях животных. Он присутствует в основном в легочном сурфактанте, где функции его не ясны - предполагают, что он играет роль в связывании сурфактантных белков. Показана роль ФГ как физиологического активатора ядерной протеинкиназы С [76].
КЛ присутствует главным образом в митохондриях, где локализуется во внутренней мембране. Полагают, что КЛ играет специфическую роль в функционировании митохондрий за счет взаимодействия с рядом митохондриальных белков. КЛ может участвовать в доставке белков внутрь митохондрий [32].
3.4. Сфингомиелин и другие сфинголипиды.
Сфингомиелин (СМ) как структурный элемент клеточных мембран привлекает внимание исследователей уже почти 100 лет, но только недавно были получены доказательства его регуляторной роли в важнейших клеточных процессах [77 - 81]. В последние годы представления о роли СМ и его метаболитов в обеспечении функционирования биомембран значительно расширились. При этом изучалась роль не только самого СМ, но и ряда его метаболитов, таких как церамиды и различные производные сфингозинового основания.
Как известно, присутствие в мембранах СМ, с его
93
длинноцепочечным основанием и насыщенной жирной кислотой, придает мембране жесткость. Возможно, именно с этим связано преимущественное распределение этого ФЛ в тканях сосудов и нервных волокнах, тканях с наибольшими требованиями к механической прочности составляющих их клеток. С особенностями этих тканей сопряжено, вероятно, и другое свойство СМ - высокая афинность к холестерину. Показано наличие тесной взаимосвязи сфингомиелина с холестерином в клетках, что подтверждается повышенным их содержанием в одних и тех же клеточных компартментах - плазматической мембране и аппарате Гольджи [82].
Накоплено много экспериментальных данных, доказывающих участие некоторых сфинголипидов, в частности, сфингомиелина и его метаболитов, в регуляции ряда важнейших клеточных процессов [83, 84]. Показана роль сфинголипидов в процессах апоптоза, миграции, клеточной адгезии, в регуляции тонуса сосудов, ангиогенезе, в патогенезе атеросклероза и его осложнений, в проявлениях кардиотоксичности, вызванных антрациклинами. Установлено, что СМ через активацию эндотелиальной NO-синтазы участвует в регуляции образования NO, которое приводит к зависимой от эндотелия вазорелаксации [79, 85].
На различных типах клеток различных видов животных показано, что сфинголипиды могут быть вовлечены в процессы регуляции роста и пролиферации клеток в качестве ключевых сигнальных молекул [77]. Обнаружена ранее неизвестная
способность сфинголипидов усиливать воздействие некоторых внеклеточных эффекторов [86]. Например, сфинголипиды участвуют в сигнальных процессах, инициированных цитокинами, факторами роста и липопротеинами, которые играют ключевую роль в ангиогенезе, а в определенных условиях и в развитии сосудистой патологии. Так, экспериментально было показано, что воздействие таких повреждающих агентов, как TNF, окисленных ЛНП, интерлейкина-1 и 2, и др. вызывает в эндотелиальных, гладкомышечных клетках, тромбоцитах и кардиомиоцитах генерацию церамидов, СФ, S1P и других производных сфинголипидов [87].
Результаты многочисленных исследований последних лет свидетельствуют о том, что такие производные сфинголипидов, как церамиды, сфингозин и сфингозин-1-фосфат являются вторичными мессенджерами многих важнейших клеточных процессов. Например, установлено, что пролиферация [88], дифференцировка [89] или апоптоз клеток [90] могут быть
94
инициированы гидролизом СМ с последующим накоплением церамидов. Также было показано, что еще до проявления начальных этапов атеросклеротического поражения - пролиферации гладкомышечных клеток сосудов - увеличивается активность сфингомиелиназы (СМазы), сопровождающаяся образованием сфинголипидных метаболитов [91].
Кроме того, церамиды или продукты их метаболизма являются медиаторами некоторых межклеточных регуляторов, таких как цитокины, факторы роста, стрессорные агенты. Показано, что воздействие этих регуляторов на клетку приводит к генерации в ней церамида и его производных. Добавление экзогенных производных сфинголипидов к культуре клеток имитирует биологические эффекты цитокинов и факторов роста [92, 93]. "Вмешательство" во внутриклеточный синтез сфинголипидных медиаторов меняет биологический ответ клетки на внешние стимулы [94, 95]. Образование сфинголипидных медиаторов и пути их активации универсальны в природе: они присутствуют как в клетках прокариот (дрожжей), так и высших эукариот (человека).
Полагают, что именно накопление церамида в клетке является характерным проявлением апоптоза - программируемой гибели клетки. Установлено, что вызывающие апоптоз многочисленные стрессовые воздействия окружающей среды приводят к внутриклеточной генерации церамидов. При этом транслокация СМ в рафтах обеспечивает в дальнейшем участие образованных из него церамидов в передаче сигнала при апоптозе.
Апоптотический "раздражитель" индуцирует потерю
асимметрии в плазматической мембране. Фосфатидилсерин при этом оказывается на несвойственной ему внешней стороне мембраны, а СМ, наоборот, медленно вытесняется из нее, передвигаясь на цитоплазматическую сторону, где вероятно, и проходит его гидролиз СМазой и образование церамида [96]. Такие процессы, когда внешний монослой лишается своего СМ не только за счет его транслокации, но и за счет гидролиза, оказывают влияние на физико-химические свойства мембраны. Меняется жидкостность микродоменов плазматических мембран, происходит перераспределение холестерина по направлению к внутренней части клетки или к внеклеточному акцептору (липопротеину). Все эти изменения приводят к активации процессов апоптоза [97].
Было показано, что таким поверхностным изменениям препятствует добавление СМ к апоптозной клетке, на основании чего предположили, что определяющим фактором морфологических изменений в апоптозной клетке является не
95
образование церамида, а уход с поверхности СМ и его гидролиз [96]. Хотя представления о том, насколько важной является связь между апоптозом и образованием церамидов в клетке, окончательно не сформировались, большинство исследователей подтверждают ее существование. Например, клетки эндотелия легких, тонкого кишечника и спинного мозга у мышей, лишенных СМазы (и не продуцирующих церамид), оказались устойчивыми к индуцированному радиацией апоптозу, а добавление церамида к ним способствовало индукции апоптоза [98 - 100]. Выявлена связь апоптоза эндотелиальных клеток с генерацией церамида при вызванном липополисахаридом септическом шоке [101]. Установлено, что церамиды играют специфическую роль в апоптозе кардиомиоцитов, индуцированном противоопухолевым антибиотиком доксорубицином, активирующим СМазу. Ингибирование активации СМазы L-карнитином, блокирующим генерацию церамидов, предотвращало повреждение кардиомиоцитов и снижало апоптоз [102].
Пути передачи сигналов в эндотелиальных клетках, вовлеченых в индуцированный сфинголипидами апоптоз, включают ингибирование связанных с выживанием клеток процессов, таких как действие PKB/Akt (серин-треониновая протеин-киназа В) и/или процессов активации классических каскадов каспаз [103, 104]. Апоптоз эндотелиальных клеток, индуцированный экзогенными церамидами, можно предотвратить добавлением эндотелиального васкулярного фактора роста [104, 105] или генерацией S1P [106]. Вероятно, так же, как и для других типов
клеток [107], соотношение или биостатус церамид/S1P может модулировать апоптоз сосудистых клеток, либо поддерживает их жизнеспособность за счет тонкой регуляции ключевых ферментов метаболизма сфинголипидов [108 - 110].
Одним из наиболее подробно изученных процессов с участием сфинголипидной регуляции клеточного сигнала является апоптоз, индуцированный фактором некроза опухоли - α-TNF. В 2002 г. S.Malagarie-Cazenave и др. [111] предложили схему сфинголипидного сигналинга, некоторые элементы которой могут иметь общие черты и с другими процессами передачи сигнала с участием сфинголипидов.
α-TNF (tumor necrosis factor) - относится к семейству цитокинов; он может связываться с множеством родственных рецепторов, активация которых является необходимым условием таких важнейших для жизнедеятельности клетки процессов, как пролиферация, дифференцировка, апоптоз. Чаще всего активацию этих процессов связывают с присутствием в клетке двух типов
96
рецепторов к α-TNF - TNFR1 и TNFR2.
Сигнальные пути, опосредующие эффекты α−TNF, еще полностью не изучены, но известно, что они включают фосфорилирование и дефосфорилирование специфических белков, активацию СМаз, некоторых транскрипционных факторов и образование активных форм кислорода.
Ранние наблюдения показали, что TNF способен запускать деградацию СМ и генерацию церамидов [89] в различных типах клеток. Например, добавление α-TNF к культуре клеток фибробластов человека вызывало в последующие 50-60 минут активацию нейтральной СМазы, гидролиз СМ и генерацию церамидов в клетках. Эти же процессы, но со скоростью в 10 раз выше, наблюдались в культуре опухолевых клеток U937. Кроме того, было показано, что синтез церамидов активируется с участием рецептора к α-TNF - TNFR1 [112 - 114].
Согласно Malagarie-Cazenave и др. [111], взаимодействие сфинголипидов с эффекторами и рецепторами α-TNF в процессе апоптоза происходит по следующей схеме:
-при связывании α-TNF происходит тримеризация TNFрецептора (TNFR1), что индуцирует мобилизацию некоторых белков к цитоплазменному домену рецептора, обозначенному как DD ("домен смерти", "death domain").
-образующийся комплекс служит адапторным белком, способным активировать кислую СМазу;
-другой фрагмент активированного рецептора (NSD) участвует в активации нейтральной СМазы;
-образующийся при воздействии СМаз на сфингомиелин церамид действует на специфические белки - каспазы, вызывающие апоптоз (см. главу 4).
Такой механизм подтверждается тем, что синтез церамидов блокируется в клетках, устойчивых к цитотоксическому эффекту TNF, а наследственный дефект или ингибирование СМаз разобщает апоптоз.
Полагают, что в дальнейшем эти результаты, по-видимому, смогут найти клиническое применение, так как некоторые патологические состояния человека характеризуются аномальной продукцией TNF или изменением его взаимодействия с рецептором (септический шок, болезнь Крона, ряд воспалительных процессов).
Помимо апоптоза сфинголипиды и их производные участвуют в
реализации и других биологических эффектов |
α-TNF: |
|
дифференцировки моноцитов, |
пролиферации фибробластов, |
|
экспрессии адгезивных молекул |
и резистентности к |
инсулину. |
97
Например, образование церамидов, индуцированное бактериальной СМазой или фактором некроза опухоли, вызывает Е-селектин-зависимую адгезию нейтрофилов к эндотелиальным клеткам человека [115, 116]. В других исследованиях [117] показано, что фактор некроза опухоли индуцирует активность сфингозин-киназы и накопление S1P, приводящее к увеличению специфических адгезивных молекул, Е-селектина и VCAM-1 (vascular cell adhesive molecule), экспрессируемых через активацию NFκB и MAPK [118, 119].
3.5. Биологические эффекты лизофосфолипидов.
Важное место в метаболизме ФЛ занимают лизоФЛ, которым принадлежит и существенная доля регуляторных функций фосфолипидов [120]. ЛизоФЛ состоят из большой гидрофильной полярной "головки", прикрепленной к глицериновому или сфингозиновому "скелету", и одной длинной гидрофобной углеводородной цепи - остатка жирной кислоты для лизоглицероФЛ, или сфингоидного основания для лизоСФЛ.
В биологических мембранах лизоФЛ присутствуют, как правило, в очень низких количествах (0,5-6% общего веса липидов мембран), что объясняют особенностями их химической структуры. Наличие более гидрофильной полярной "головки", чем в обычных ФЛ, и только одной длинной углеводородной цепи, придают лизоФЛ более выраженные сурфактантные и детергентные свойства. Высокие концентрации лизоФЛ нарушают целостность мембран, воздействуют на активности многих
мембранных ферментов и могут даже приводить к лизису клеток [120].
Несмотря на низкие концентрации, лизоФЛ широко распространены в животных тканях и липопротеинах. В крови лизоФЛ обнаруживаются в связанном с альбумином виде. Концентрация лизоФЛ повышается при активации тромбоцитов, при повреждении тканей, воспалении и неоплазии. Биологические функции лизоФЛ сопряжены с ростом клетки, включая пролиферацию, дифференцировку и процессы ее выживания, а также с подавлением апоптоза.
При низких не токсичных концентрациях лизоФЛ могут действовать как липидные вторичные мессенджеры, преобразуя сигналы, полученные от мембранных рецепторов, а также проявляя множественные биологические активности.
Лизофосфолипидные медиаторы генерируются в мембранах клеток в ходе специфического ферментативного расщепления глицерофосфолипидов и сфинголипидов.
98
3.5.1. Лизосфинголипиды.
Лизосфинголипиды образуются при гидролизе СМ с последующим обратимым расщеплением церамида до сфингозина и дальнейшим возможным фосфорилированием последнего до S1P. В последние годы это соединение привлекает внимание исследователей из-за выявленной высокой биологической активности.
В экспериментах in vitro на модельных системах показана важная регуляторная роль S1P в ангиогенезе [121 - 123]. Он способен увеличивать пролиферацию и хемотаксис эндотелиальных клеток, стимулировать образование капилляров в культуре клеток, растущих на коллагеновом геле [123, 124], усиливать действие фактора роста фибробластов на ткани рогового слоя у мышей [125]. Существует точка зрения, что именно S1P, поступающий в клетку после высвобождения из тромбоцитов, или вносимый в нее окисленными ЛНП, а также синтезированный внутри клетки, может участвовать в пролиферации клеток сосудистой стенки, вызывая ее утолщение и стабилизацию атеросклеротической бляшки [126].
Уровень S1P контролируется в клетке путем строгой координированной регуляции нескольких ферментов - сфингозинкиназы, S1P-фосфатазы и S1P-лиазы [127]. Показано, что из-за относительной водорастворимости S1P может покидать как мембрану, так и саму клетку. Биологические эффекты S1P различны и связаны с его локализацией внутри или вне клетки [128].
Помимо S1P, в последние годы был открыт еще один активный лизосфинголипидный регулятор - сфингозил-фосфорилхолин (SPC), продукт деацилирования СМ. Некоторые эффекты SPC связывают с его предполагаемой способностью к активации NOсинтазы и действием на связанный с ней метаболический путь [85]. Вместе с S1P SPC был обнаружен в ЛНП, особенно в их окисленных формах. Показано, что и S1P, и SPC являются ключевыми сигнальными молекулами, вовлеченными в стимуляцию клеточного роста [129]. Имеются данные, что, по крайней мере, часть митогенного и атерогенного эффектов ЛНП обусловлены связанными с ними S1P и SPC [130, 131].
Показано, что сфингозин, S1P и SPC являются потенциальными кальций-мобилизующими агонистами: S1P усиливает инициируемое сфингозином высвобождение внутриклеточного Са2+ [132], а SPC может мобилизовать Са2+ в гладкомышечных и эндотелиальных клетках [133, 134].
Регуляторные воздействия лизосфинголипидов часто
99
сочетаются с действиями лизоФЛ, особенно лизоФК, поэтому в последнее время уделяется большое внимание комплексному действию этих лизоФЛ.
3.5.2. Лизоглицерофосфолипиды.
Наиболее распространенным лизоглицерофосфолипидом в клеточной мембране является лизоФХ; он представлен также в ЛНП крови, особенно в окисленно модифицированных ЛНП, а также в безлипопротеиновой фракции сыворотки в комплексе с альбумином. ЛизоФХ составляет в среднем 6 - 9% от всех ФЛ сыворотки. Другие лизоФЛ присутствуют в сыворотке и в липопротеинах в значительно меньших, не определяемых при обычном фосфолипидном анализе количествах. Установлено, что концентрации лизоФК и S1P в нормальной сыворотке могут составлять приблизительно 10 мкМ и 0,5 мкМ соответственно [135, 136].
Увеличение уровня лизоФЛ в результате измененного метаболизма мембранных фосфолипидов связано с развитием ряда заболеваний, таких, как ишемия и аритмия миокарда, ишемия и демиелинизация периферических нервов.
Долгое время различные эффекты лизоФЛ объясняли в основном их поверхностно-активными или детергентными свойствами. Использование новых методических подходов (высокоразрешающих оптических методов, различных зондов, модельных мембранных систем и др.) позволило исследователям добиться существенных успехов в выяснении роли и участия этих соединений в жизнедеятельности клетки и, особенно, в
трансдукции клеточных сигналов.
В связи с большей доступностью лизоФХ по сравнению с другими лизо-производными, большинство исследований биологических эффектов в течение ряда лет проводили именно на этом лизоФЛ. Было установлено, что, воздействуя на генную экспрессию, лизоФХ оказывает влияние на клеточные ответы. ЛизоФХ участвует в проявлении некоторых биологических функций липопротеинов, стимулирует рост макрофагов, обуславливает опосредованные протеинкиназой С активацию Т- лимфоцитов и дифференциацию HL-60 клеток в макрофаги [137].
Получены данные, что лизоФХ оказывает митогенный эффект на макрофаги мышей, индуцируя экспрессию генов ростовых факторов, вовлеченных в атерогенез и воспалительные процессы. Он может регулировать экспрессию молекул адгезии на поверхности эндотелиальных клеток, модулировать зависимую от эндотелия артериальную релаксацию, проявляя, таким образом, вазоактивные свойства [138].
100