или Fas-L приводят к развитию аутоиммунных заболеваний [25]. Описан апоптоз, индуцированный связыванием рецепторов
семейства TNF, которые также содержат домены DD (TNF-R) с лигандом TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand). Их олигомеризация при связывании, аналогична Fas-R/Fas-L и осуществляется с участием FADD и сходного с ним белка TRADD (TNF-R-ассоциированного DD) [34, 35].
Каспазы, специфические цистеиновые протеазы, катализирующие ограниченное расщепление клеточных белков, считают ключевыми ферментами в развитии апоптоза [36]. Каспазы расщепляют пептидную связь по карбоксильному концу остатка аспарагиновой кислоты (Asp), что приводит к активации или инактивации белка [36, 37]. Всего идентифицированно 14 каспаз. Они синтезируются в виде зимогенов большего молекулярного веса - прокаспаз, которые затем активируются путем протеолитического процессирования [36-38].
По функциональным свойствам семейство каспаз подразделяют на два главных подсемейства. Каспазы -1, -4 и -5 участвуют в активации (созревании) цитокинов, таких как интерлейкин-1β, интерлейкин-18, усиливая их провоспалительные свойства. Остальные каспазы, участвующие в апоптозном ферментативном каскаде, подразделяются на эффекторы, т.е. ферменты, непосредственно гидролизующие структурные белки клетки, и индукторы - принимающие и передающие апоптотический сигнал. Структурные особенности и конформационные изменения каспаз в процессах инициации и активации апоптоза подробно описаны в
различных обзорах [36, 37, 39-41].
Среди молекулярных мишеней эффекторных каспаз известны многие белки, деградация которых вызывает развитие необратимых процессов, характерных для апоптоза. К ним относятся мембранные белки, белки цитоплазмы и ядерной ламины [42, 43].
Регуляция активности каспаз в интактной клетке происходит за счет: (1) взаимодействия индуктора апоптоза со специфическими рецепторами (например, активация каспазы 8 в Fas/Fas-L системе);
(2) образования гетеродимеров каспаз со специфичными регуляторными белками семейства Bcl-2; (3) взаимодействия каспаз с сериновой протеазой - гранзимом В (GrB) (например, при воздействии на клетку цитотоксических Т-лимфоцитов) [44]. В настоящее время еще не до конца понято, каким образом эффекторные каспазы активируются после связывания рецепторов клеточной гибели.
Предполагают, что воздействие каспаз на белки цитоскелета
121
приводит к изменению формы клетки.
В последнее время получены доказательства того, что ингибиторы каспаз не полностью блокируют некоторые морфологические проявления апоптоза, например, сморщивание клеток [45]. Появляется все больше данных, указывающих, что каспазы не охватывают все аспекты апоптоза у млекопитающих, и исследователи продолжают предлагать новые адекватные, независимые от каспаз, клеточные модели апоптоза. Например, посредством активации нуклеазы при помощи высвобождаемого из митохондрий белка - фактора, индуцирующего апоптоз (apoptosis inducing factor, AIF) [46].
4.2.3. Митохондриальный путь апоптоза.
Некоторые индукторы апоптоза способны вызвать увеличение проницаемости мембран митохондрий, воздействуя на них либо непосредственно, либо через активацию других проапоптотических механизмов [47]. Например, активные формы кислорода (АФК), оксид азота, некоторые токсины, вирусные белки, лекарства вызывают апоптотическую гибель клеток независимо от активации других инициаторных систем, таких, как "рецепторы смерти" [19, 20, 47-51].
Действие этих индукторов апоптоза приводит к резкому снижению величины электрохимического потенциала митохондрий ∆Η+ и сопровождается выходом из них цитохрома с. Последний, высвобождаясь в цитоплазму, инициирует активацию каспаз [20, 32]. Наряду с цитохромом ñ возможно высвобождение в цитоплазму и других локализованных в митохондриях
проапоптотических медиаторов - прокаспазы-2, -3 и -9, AIF, эндонуклеазы G и др. [45]. Считают, что их выход из митохондрий контролируется специальными белками семейства Bcl-2 [52].
Белки семейства Bcl-2 являются самыми известными внутриклеточными регуляторами апоптоза и характеризуются наличием гомологичных доменов, называемых ВН 1-4-доменами. Функционально члены Вс1-2 семейства разделяются на антиапоптотические (Bcl-2, Bсl-х, Mcl-1) с доменами ВН 1, 2 и 4, и проапоптотические (Вid, Bad, Bax, Bim) с доменом ВН 3 [18, 53]. Например, белок Вid (tBid), взаимодействуя с митохондриальными липидами, индуцирует высвобождение из этих органелл эндонуклеазы G [54, 55] и внедрение лизофосфолипидов (особенно лизоФХ) в мембрану митохондрий с возможным последующим ее разрывом [56]. Эти эффекты, как предполагают, обусловлены тем, что С- концевые домены проапоптотических белков Bcl-2 "заякорены" в мембране, что способствует их воздействию на мембраны ЭР или митохондрий [18] с возможным вовлечением в формирование пор [18, 52].
Белки семейства Bcl-2 могут образовывать как гомодимеры, так
122
и гетеродимеры из белков, обладающих разнонаправленным действием. При этом каждый из них способен подавлять функцию другого. Считают, что соотношение белков семейства Bcl-2 в значительной степени определяет предрасположенность или устойчивость клетки к апоптозу [57, 58].
Многие исследователи отмечают, что для большинства типов клеток общей чертой апоптоза является деполяризация митохондрий, которая сопряжена с глубокими изменениями проницаемости митохондриальных мембран, с образованием гигантских транзитных пор - мегаканалов (permeability transition pore, PTP) [59, 60-63]. Одним из видов РТР является, например, неспецифический канал, образующийся при окислении SHгруппы Cys-56 в адениннуклеотидтранслоказе - белке внутренней мембраны митохондрий, осуществляющем антипорт АТФ/АДФ) [46]. Образующий поры комплекс содержит множество мишеней для внешнего воздействия и регулируется многими эндогенными факторами, такими как оксид азота, АФК, концентрацией ионов (Ca2+ è Mg2+), изменения ∆Η+, концентрация АДФ и АТФ, липидов и определенных белков, изменение соотношения белков Bcl-2 и др. [59-64].
Судя по всему, гигантская пора интегрирует различные ответные реакции клетки на стресс, и почти при всех процессах клеточной гибели происходит ее раскрытие, изменяющее митохондриальную проницаемость.
Если начальные фазы апоптоза различаются в зависимости от типа клеток и от индуцирующего сигнала, то этап деградации ДНК универсален для большинства клеток. Эта фаза является переходом
к необратимой - терминальной стадии апоптоза, которую также контролируют белки семейства Bcl-2, кодируемые одноименными генами. Деградация ДНК при апоптозе осуществляется эндонуклезами, включая высвобождаемую из межмембранного пространства митохондрий эндонуклеазу G [65, 66].
К изученным белкам - регуляторам апоптоза относят фактор транскрипции р53, который способен блокировать процессы деления клетки с поврежденной ДНК, "запуская" апоптоз [25, 67]. Этот белок с молекулярной массой 53 кДа локализован в ядре клетки. На ранних стадиях повреждения ДНК его экспрессия повышается, блокируя клеточный цикл в фазе G1 и G2, до репликации ДНК и митоза. Это дает возможность репарировать поврежденную ДНК, предотвращая тем самым появление мутантных клеток. Если активность репарационных систем недостаточна и повреждения в ДНК сохраняются, то в таких клетках индуцируется апоптоз. Накопление в клетке белка р53 возможно при обоих путях апоптоза [67, 68]. В то же время у более
123
чем 50% изученных видов опухолевых клеток ген р53 инактивирован, связанная с ним регуляция клеточного гомеостаза нарушена; следствием чего оказывается накопление мутированных клеток [69-71].
Важным компонентом индукции апоптоза во многих типах клеток является уровень свободного ионизированного кальция в цитоплазме. Полагают, что повышение уровня Ca2+ в клетке способствует "запуску" митохондриального апоптозного сигнального каскада, инициируя образование транзитных пор [72], выход цитохрома ñ и эндонуклеазы G, [73]. В высвобождении Ca2+ из внутриклеточных депо участвуют вторичные мессенджеры - диглицерид и инозитол-1,4,5- трифосфат (IP3), генерация которых в клетке связана с активацией различных изоформ фосфолипазы С. Некоторые токсины также способны стимулировать апоптоз путем нарушения нормального гомеостаза кальция, но при условии сохранения основного пула АТФ; иначе клетка может перейти к некрозу [26].
В процессе апоптоза может участвовать цитозольная фосфолипаза А2 (cPLÀ2). Так, для Fas-индуцированного апоптоза cPLА2 является субстратом каспазы-2 и -8 [74]. Возможно, что инактивация cPLА2 приводит к снижению синтеза провоспалительных простагландинов, образующихся из арахидоновой кислоты. Последняя, как известно, является продуктом гидролиза фосфолипидов cPLА2 [75]. В то же время, для TNF-индуцированного апоптоза была показана активация cPLА2 каспазой-3, что, как считают, необходимо для выхода других каспаз [76].
Zhao с соавт. [77] отмечают, что участие фосфолипазы А2 усиливает повреждение лизосом, роль которых в программируемой гибели клеток активно обсуждается в последние годы. Так, было показано, что высвобождение митохондриями проапоптотических факторов может быть следствием предшествующей дестабилизации лизосом с участием фосфолипазы А2 [78, 79]. Авторы предполагают существование "лизосомно-митохондриальной оси" апоптоза, определяющей и координирующей эффект каспаз, лизосомальных гидролаз и генерацию митохондриями АФК. Окончательная реализация того или иного апоптозного сигнального каскада определяется путем перекрестных сопряженных друг с другом реакций ("cross-talk") между взаимовлияющими эффекторами [77]. Важная роль лизосом в реализации апоптоза отмечается и другими авторами [80]. На
124
Рис. 4.2.2. Некоторые пути передачи апоптозных сигналов в клетке (по [46] с изменениями)
Активные формы кислорода (АФК) способствуют раскрытию в митохондриальной мембране пор (РТР), через которые в цитоплазму выходит цитохром ñ, активирующий каскад каспаз, приводящий к апоптозу. Рецептор TNF, после взаимодействия с лигандом, также активирует каспазу-3 посредством каспазы-8. Последняя может инициировать цепь событий, ведущих к раскрытию РТР и выходу митохондриальных апоптотических белков без участия АФК. Фосфатидилсерин (ФС) внутреннего слоя плазматической мембраны переходит на внешний, частично окисляясь (ФСîê) с участием АФК, что служит сигналом для узнававния и удаления апоптозной клетки (по [46])
рис. 4.2.2. схематически представлены некоторые пути передачи апоптозных сигналов в клетке [46].
4.2.4. Апоптоз и фосфолипиды.
Конечным этапом апоптоза считают фрагментацию клеток на "апоптотические тельца" и поглощение их соседними клетками или макрофагами. На этом этапе наиболее существенные процессы протекают в плазматической мембране. Так, в мембране наблюдается перераспределение ФЛ, экстернализация ФС во внешний монослой мембраны [81, 82] и последующее его окисление [83]. Транслокация ФС при апоптозе осуществляется с участием Са2+-активируемой скрамблазы [84] или при свободнорадикальном окислении кардиолипина митохондрий [85]. Перемещение ФС является сигналом ("eat me") для поглощения поврежденной клетки окружающими клетками с участием "рецептора внешнего ФС", локализованного в плазматической мембране [46, 84]. По мнению Henson с соавт. [84], рецептор ФС экспрессируется в различных клетках и тканях, благодаря чему апоптотические клетки или "тельца" могут захватываться и перевариваться не только фагоцитами, но и простыми клетками. При этом рецепторы к ФС оказывают также и
125
противовоспалительное действие, подавляя иммунную реакцию фагоцитирующей клетки.
Отмечают, что в апоптотической клетке возрастает генерация лизоФХ, который в данном случае является хемотаксическим фактором (источником сигнала "seak me"), стимулирующим приток фагоцитов к апоптозной области [82].
Âряде работ последних лет продемонстрирована специфическая роль мембранных рафтов (см. главу 2) в процессах апоптоза [86, 87], которая, в частности, связана с регуляцией ионных каналов и организацией ("сборкой") сигнальных комплексов. При этом, стимулы апоптоза вызывают реорганизацию рафтов, их укрупнение в большие, обогащенные церамидами мембранные платформы [86].
Âкачестве сигнальных вторичных мессенджеров в процессы апоптоза вовлечены такие производные ФЛ, как церамиды, сфингозин и S1P (см. часть 3) [88], которые способны регулировать выживание или гибель клетки [89]. Так, церамид, образующийся в клетках из сфингомиелина мембран в ответ на различные стрессовые сигналы (цитокиновая атака, радиация и др.), действуя как вторичный мессенджер апоптоза, способен активировать его ключевые регуляторы. Образование церамида во внешнем слое клеточной мембраны, вызывает полярное перераспределение и олигомеризацию ("образование шапки") рецептора Fas [90]. При этом на цитоплазматической стороне мембраны формируется суперкаталитический домен, усиливающий Fas-опосредованный апоптоз. Церамид способен также усилить дестабилизацию
митохондриальных мембран и высвобождение апоптогенных факторов. Например, усиливая Вах-индуцированную проницаемость мембраны, церамид инициирует формирование неспецифичных "церамидных" пор, которые повышают проницаемость наружной мембраны митохондрий и усиливают высвобождение цитохрома ñ [91]. Сфингозин, образующийся из церамида под действием церамидаз, также способен усиливать апоптоз, ингибируя протеинкиназу С [92]. Из церамида образуется также S1P - сигнальный липид, обладающий антиапоптотическими свойствами (см. главу 3) [93]. Его эффекты реализуются разными механизмами: (1) S1P активирует антиапоптотические сигнальные пути (NFkB, киназа ERK - Extracellular signal Regulated Kinase); (2) в лимфоцитах S1P снижает экспрессию проапоптотических Bcl-2 (Bax), блокируя апоптоз; (3) S1P может оказывать антиапоптотическое действие, предотвращая индуцированные стрессом процессы в митохондриях (например, блокируя высвобождение из них цитохрома ñ и предотвращая активацию
126
каспаз); (4), в эндотелиальных клетках S1P блокирует апоптоз, повышая продукцию NO [93, 94].
Таким образом, апоптоз или запрограмированная гибель клетки представляет собой сложный, генетически контролируемый многостадийный биохимический процесс, не все стороны которого полностью выяснены. Хотя повреждение мембраны не является первопричиной апоптоза, в настоящее время показано, что мембрана является важным участником сложных апоптозных реакций. Именно в плазматической мембране происходит олигомеризация и нужная ориентация апоптозных рецепторов, а также локализация многих апоптозных сигналов, в том числе и сигнала "eat me", связанного с экстернализацией ФС. Для другой формы гибели клетки - некроза - повреждения мембраны и связанное с ними возрастание ионной проницаемости является ключевыми в механизмах клеточных повреждений.
4.3. Некроз и повреждение биомембран.
Некроз, в противоположность апоптозу, - пассивная форма быстрой гибели клеток под влиянием интенсивных внешних воздействий, на которые клетка не может или же не успевает отреагировать с помощью своих защитных систем, и они вызывают нарушение функций клеточных органелл, в первую очередь, наружной мембраны клеток. Все многообразие факторов, вызывающих некроз, условно можно разделить на физические, химические и биогенные. К последним относятся бактериальные и вирусные инфекции, аллергические, аутоиммунные факторы и т.
д. Клеток, устойчивых к факторам, вызывающим некроз, нет, хотя чувствительность к ним различна. Некроз, в отличие от апоптоза, обязательно сопровождается автолизом клетки [1, 2, 19] (рис. 4.2.1), в ходе которого клетка лизируется, ее содержимое изливается в межклеточное пространство, создавая область воспаления, являющуюся отличительной чертой некроза.
Механизмы развития некроза сложны и определяются характером патогенных воздействий, структурнофункциональными особенностями ткани, наследственноконституциональными факторами организма. В зависимости от механизма действия патогенного фактора различают прямой некроз, обусловленный непосредственным воздействием (травматический и токсический некрозы), и непрямой - возникающий опосредованно через сосудистую и нейроэндокринную системы.
Морфологически некротическая клетка существенно отличается от апоптозной. Наблюдается распад ядра на отдельные
127
фрагменты (глыбки, clumps) - кариорексис и его лизис (кариолизис). Митохондрии набухают, повреждается их внутренняя мембрана, происходит лизис и дезинтеграция крист [95]. Плазматическая мембрана выпячивается, образуя пузыри ("блеббинг" мембраны). В цитоплазме происходят диссоциация и диспергирование полирибосом, за счет чего увеличивается ее вязкость и появляется гранулярная неоднородность. Происходит денатурация и коагуляция белков, набухание и фрагментация цистерн шероховатого ЭР и аппарата Гольджи [2, 96].
Разрушение мембранных структур клетки ведет к ее гидратации, наступает плазмолиз (гидролитическое "расплавление" цитоплазмы), который в одних случаях охватывает всю клетку (цитолиз), в других - лишь ее часть (фокальный колликвационный некроз, или баллонная дистрофия). При фокальном некрозе может произойти полное восстановление наружной мембраны клетки. Если воздействие повреждающего агента продолжается, происходит лизис клетки и необратимые изменения межклеточного вещества, его волокнистых структур.
Общим морфологическим признаком некроза, в отличие от апоптоза, является набухание клетки, приводящее к разрыву ее мембраны. Морфо- и патогенез некроза хорошо изучены и подробно описаны в литературе [1, 3, 14, 19, 20, 97 и др.].
Âотличие от апоптоза, поражающего единичные, беспорядочно расположенные клетки, некроз, как правило, развивается одновременно в большой группе клеток, подвергающихся общим интенсивным воздействиям. Значение некроза определяется его
сущностью как "местной смертью" и выключением из функции зон ткани, поэтому некроз жизненно важных органов, особенно крупных их участков, нередко ведет к смерти. Таковы инфаркты миокарда, ишемические некрозы головного мозга, некрозы коркового вещества почек, прогрессирующий некроз печени, острый панкреатит, осложненный панкреонекрозом. Нередко омертвение ткани является причиной тяжелых осложнений многих заболеваний. Клинические проявления некроза отличаются большим разнообразием [98].
Несмотря на то, что некроз вносит определенный вклад в патогенез многих заболеваний человека, его молекулярные механизмы остаются недостаточно изученными. Это отчасти обусловлено тем, что некроз, в отличие от апоптоза, представляет собой сумму непрограммируемых, максимально деструктивных процессов [99].
Âто же время исследования последних лет, проведенные на различных животных, позволили выявить некоторые общие
128
биохимические закономерности клеточной деструкции при некротической гибели. Согласно современным представлениям, "было бы ошибкой рассматривать некроз как менее упорядоченный и регулируемый процесс, чем апоптоз" [100].
Несмотря на сходство некоторых деструктивных процессов при апоптозе и некрозе (повреждение митохондрий, нарушение гомеостаза Са2+, генерация АФК), принципиальным отличием некроза, помимо отсутствия зависимости от энергетического статуса клетки, является отсутствие генетического контроля и специфических белков-регуляторов некротического процесса; вместо этого - подчинение биохимическим закономерностям сопряженных друг с другом структурно-функциональных процессов, действующих в соответствии с общей закономерностью возрастания энтропии.
4.3.1. Биохимические процессы при некрозе.
Отмечают несколько важнейших биохимических каскадов, общих для некротического пути гибели клетки, несмотря на разную природу повреждающего агента:
-нарушение окислительного фосфорилирования (синтеза АТФ) и гликолиза;
-нарушение гомеостаза Са2+ (накопление внутриклеточного Са2+) [101];
-увеличение проницаемости плазматической мембраны и мембран внутриклеточных органелл;
-генерация АФК и свободных радикалов;
-необратимое разрушение митохондрий;
-повреждение ядра клетки, активация эндонуклеаз, деполимеризация нуклеиновых кислот (дезинтеграция ДНК и РНК).
По мнению B.Padanilam [20], определяющими детерминантами некроза являются механизмы ионного гомеостаза. При прямом повреждении клетки происходит повреждение целостности мембраны, и изменение гомеостаза клетки не вызывает сомнений.
Âслучае непрямого некроза, например, при ишемии, происходит, прежде всего, резкое энергетическое "истощение" клетки вследствие разобщения митохондриальных процессов окислительного фосфорилирования. При этом существенно снижается синтез АТФ, нарушается работа АТФ-зависимых ионных каналов, происходит потеря регуляции ионного гомеостаза, разрушение белков цитоскелета [102]. Плазматическая мембрана теряет способность регулировать клеточный объем и ионную
проницаемость. Усиленный транспорт ионов приводит к потере осмотического равновесия, увеличению концентрации Na+ â
129
цитозоле. Это активирует Na+-K+-АТФазу, истощая еще больше запасы АТФ в клетке и способствуя набуханию митохондрий и клетки в целом (отек клетки). В начальной стадии повреждения
ионный гомеостаз в клетке еще поддерживается одновременным оттоком К+. Однако по мере снижения уровня АТФ ионные насосы блокируются, и приток в клетку Na+ и воды увеличивается.
В последние годы на различных клеточных культурах установлены механизмы действия и роль таких ионных насосов и трансмембранных ионных каналов, как Na+/K+-насос, Na+/H+ è Na+/Ca2+ ионные каналы, Na+-K+-2Cl--котранспортер [103, 104]. Однако механизмы, вызывающие резкое увеличение притока Na+ в цитозоль при некрозе, до сих пор неизвестны [20].
Увеличение концентрации Na+ в клетке приводит к выключению системы Na+/Ca2+ обмена через клеточную мембрану, к повышению осмотического давления в митохондриях и клетке и их набуханию. За счет увеличения проницаемости мембраны происходит выравнивание концентраций ионов внутри и вне клетки. Концентрация Ca2+ в цитоплазме увеличивается от 10-8-10- 7 М (в норме) до 10-6-10-5 М [101]. Этому способствуют также (а) увеличение проницаемости внутриклеточных мембран, усиливающие приток Ca2+ из внутриклеточных компартментов (например, из ЭР) [2, 105], с участием протеинкиназы С и инозитол-трифосфата, и (б) развивающийся окислительный стресс [106]. К накоплению Са2+ в цитоплазме приводит и окисление SНгрупп ряда мембранных белков, вызывающее появление в мембранах дефектов, через которые ионы Са2+ по градиенту
диффундируют в клетку.
Высокие уровни Ca2+, в свою очередь, активируют:
-Ca2+-АТФазу, увеличивая потребление АТФ и вызывая деполяризацию митохондрий [105, 107];
-эндонуклеазы (гидролизующие ДНК) и специфические клеточные протеазы, такие как кальпаин, субстратом которых служат некоторые структурные и сигнальные белки клетки [108];
-генерацию митохондриями АФК, сопряженную с изменениями структуры кардиолипина митохондриальных мембран [85] и активацией PLA2 [75, 105];
-ряд "деструктивных", в том числе лизосомальных, ферментов, таких как: (1) фосфолипазы, гидролизующие мембранные ФЛ; (2)
специфические протеазы, усиливающие деструкцию мембран, включая протеазы, разрушающие места прикрепления филаментов цитоскелета к клеточной мембране, что приводит к ослаблению фиксации последней и изменению формы поверхности клеток; (3) АТФазы, увеличивающие потерю АТФ в клетке и, (4) эндонуклеазы,
130