Добавил:
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:

Литература / ИПАТОВА ФОСФОГЛИФ про печень

.pdf
Скачиваний:
53
Добавлен:
19.06.2017
Размер:
3.4 Mб
Скачать

сомнение значимость этих вирусов в повреждении гепатоцитов. Однако если исходить из того, что преобладающим видом клеточной гибели при вирусных поражениях печени является именно апоптоз, протекающий без разрушения клеточной мембраны и высвобождения трансаминаз (см. главу 4), то отсутствие корреляции между биохимическими параметрами сыворотки крови и гистологическими показателями повреждения клеток представляется естественным и не опровергает представлений о вмешательстве вирусов в процессы апоптоза.

Изучению механизмов цитопатического действия вирусов гепатитов В и С, а также взаимодействию вирус-"хозяин" в последние годы посвящено много работ, но до конца эти процессы еще не известны. Связано это как с тонкими и запутанными молекулярными механизмами взаимодействия вируса и инфицированной клетки, так и с отсутствием адекватных моделей для лабораторных исследований. Тем не менее, основная тенденция цитопатического действия вирусов гепатитов В и С (HBV и HCV) по мнению многих исследователей заключается во внедрении вирусов с помощью кодируемых ими белков в ключевые клеточные процессы и модуляция, в зависимости от ряда факторов, проили антиапоптозных процессов. Так, в ряде экспериментов было показано ингибирование апоптоза в клетках печени вирусами HCV и HВV, которое объяснялось способностью кодируемых ими белков подавлять функции проапоптогенного белка р53, инактивировать каспазы и вызывать усиленную экспрессию белков семейства bcl-2 - ингибиторов апоптоза [50, 51].

Эти выводы подтвердились при изучении отдельного влияния на апоптоз оболочечных (envelope) белков капсид и внутренних (core) белков вирусов. Так, Kountouras с соавт. [39] обнаружили про- и антиапоптозные свойства кор-белка вируса гепатита С, показав, что этот белок способен связываться с передающей сигнал областью внутриклеточного домена "рецепторов смерти" и модулировать перемещение сигнальных молекул, инициирующих апоптоз. Этому способствует возможность локализации кор-белка HCV в мембранах ЭР и митохондрий в инфицированной клетке [52]. По мнению Basu с соавт. [53], этот белок оказывает влияние на клеточную регуляцию и, как было показано для кор-белка генотипа 1а HCV, инициирует "выживание" апоптозных гепатоцитов, стимулируя гепатоканцерогенез. Также было показано, что внутренние белки HCV способны ослаблять апоптоз, вызванный церамидом [54, 58] или фактором роста TGF-β и проявляют онкогенные свойства [55].

Было установлено, что кор-белок HCV ингибирует

171

индуцированное TNF расщепление поли(АДФ-рибозо)- полимеразы (так называемого "субстрата смерти"). Предполагают, что он ингибирует апоптоз путем активации ядерного фактора NFκB, модулируя сигнальные пути, что сохраняет хроническое устойчивое состояние инфицированной клетки [56]. Ингибирующее действие на апоптоз, индуцированный TNF и бутиратом, было показано для "неструктурного белка 5А" HCV, который воздействовал на каспазу-8, но не влиял на NFκB [57].

Показаны также другие антиапоптозные механизмы действия внутреннего белка HCV, например, на митохондриальном уровне, через снижение экспрессии Bcl-x, приводящее к ингибированию активации каспазы-3 [58], или через активацию белка, связывающего р53, ингибируя тем самым апоптоз на генном уровне (см. главу 4) [50]. Chou с соавт. [59] показали, что кор-белок HCV в культуре клеток карциномы человека Huh7 инициирует TRAIL- (но не Fas)-зависимый апоптоз по механизму активации каспазы-8, гидролиза (или расщепления) Bid и нарушения функций митохондрий (см. главу 4).

В целом, в опубликованных в последние годы работах подчеркивается полифункциональность кор-белка HCV. Он способен как ингибировать TNF-индуцированный апоптоз, так и стимулировать его, приводя к персистенции вируса и, возможно, к гепатоканцерогенезу [60]. Для объяснения такого регуляторного влияния кор-белка HCV на процессы апоптоза клеток печени рассматривается его влияние на ядерный фактор NFκB, для которого, в свою очередь, в разных работах получены

противоречивые данные [41, 62 - 64]. Так, Chiao с соавт. предполагают возможность как активации, так и ингибирования апоптоза этим ядерным фактором, что требует дальнейших исследований [64]. Как считают Bantel с соавт. [61], механизмы, лежащие в основе противоположно направленных влияний вирусных белков еще недостаточно изучены, и в целом могут быть обозначены как "дисрегуляция".

Оболочечный белок HCV также включается в процессы апоптоза, но его влияние более однозначно и связано с индукцией гибели клетки [65], так же как и для оболочечного белка вируса ВИЧ 1. Полагают, что эти эффекты связаны с фосфорилированием белка р53 [66].

Антиапоптозными эффектами обладает и вирус гепатита А при воздействии на пути, связанные с PK R и dsРНК (двухцепочечной РНК) [41]. Интересно, что на поздней стадии инфекции в клетке накапливается собственная вирусная dsРНК, которая может активировать PK R, тем самым как бы нивелируя действие вируса.

172

Противодействуя этому, вирус ослабляет репликацию, а тем самым и генерацию собственной dsРНК. Репликация приобретает умеренный характер, ингибируя антивирусные механизмы и поддерживая персистентное состояние инфекции вирусного гепатита А [67].

Для Х-белка HВV показана способность индуцировать апоптоз в культуре клеток гепатоцитов путем активации белков клеточного стресса JNK (c-Jun N-terminal kinase) и p38 MAPK [68], а также кальций-зависимых сигнальных процессов [69]. Обнаружено влияние генотипа HВV и мутаций Х-белка на эти процессы [70].

Помимо прямой или косвенной индукции апоптоза вирусами, непосредственно действующими на клетки печени, другим, не менее существенным механизмом гибели инфицированных гепатоцитов является апоптоз, индуцированный клеточным иммунным ответом, в особенности, опосредованный цитотоксическими Т-лимфоцитами и NK-клетками [71-77].

Иммунное повреждение печеночных клеток при хронических вирусных болезнях печени обусловлено, во-первых, присутствием в них антигенов вирусов, во-вторых - трансформацией клеток под действием печеночных аутоантигенов, к числу которых относятся ядерный "е"-антиген (HBeAg) и поверхностный антиген (HBsAg) вируса гепатита В. Реализация иммунного цитолиза гепатоцитов происходит в виде реакции гиперчувствительности замедленного типа. Лимфотоксическая активность Т-киллеров направлена против HBeAg, а гепатоциты, позитивные к HBsAg обычно окружены CD8+-лимфоцитами, обеспечивающими фокальный

некроз инфицированных клеток.

Считают, что цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ), с одной стороны индуцируют апоптоз инфицированных клеток, а с другой - воздействуют на процессы транскрипции и репликации вируса в клетке, стимулируя секрецию ряда цитокинов, например, интерферона-γ (ИФН-γ), TNF-α и др. [78 72], чувствительность к которым в инфицированной клетке повышена [79-81]. В частности, связывание ИФН со специфическими рецепторами клетки приводит к активации внутриклеточных ферментов, например, 2',5'-олигоаденилатсинтазы, и эффекторных белков, которые, в свою очередь, активируют внутриклеточные рибонуклеазы, разрушающие вирусную РНК. ИФН ингибируют также процессы "раздевания", трансляции и сборки вирусов в процессе репликации. Один из наиболее известных ИФН-индуцируемых белков, PK R, стимулирует апоптоз, индуцированный многими различными эффекторами, включая TNF-α и вирусы. Изучение механизмов индукции апоптоза интерфероновой PK R необходимо

173

для рациональной оптимизации схем клинической интерферонотерапии [41].

Считают, что ЦТЛ инициируют апоптоз в инфицированных клетках печени двумя путями. Первый реализуется за счет выброса из Т-клеток перфорина, который образует поры в плазматических мембранах гепатоцитов. Через них в клетки проникают гранзимы - протеазы Т-лимфоцитарных гранул, вызывающие расщепление ряда внутриклеточных ферментов, в том числе каспаз, запускающих апоптозный каскад (см. главу 4). Второй путь связан с повышением экспрессии Fasрецепторов на поверхности инфицированных гепатоцитов под воздействием активированных Т-лимфоцитов. Как уже упоминалось, Fas-R усиленно экспрессируется на мембране инфицированных вирусами гепатоцитов, но особенно часто их обнаруживают на гепатоцитах, окруженных лимфоцитами на границе ступенчатого некроза и паренхимы [37]. В свою очередь, на соответствующих лимфоцитах выявляется повышенная экспрессия Fas-L, что создает условия для запуска апоптозного каскада.

Известно, что Fas-R (APO-1/CD95) экспрессируется в печени на гепатоцитах, холангиоцитах, активированных звездчатых ретикулоэндотелиоцитах и купферовских клетках и существует в мембраносвязанной и растворимой формах. Растворимая форма Fas-R, вероятно, служит для связывания Fas-L не только на СD8+- цитотоксических лимфоцитах и NK-клетках, но и СD4+-Т- лимфоцитах-хелперах 1-го типа, которые, как было недавно установлено, также могут проявлять цитотоксические свойства

[82]. Экспрессия Fas-R на мембране гепатоцитов индуцируется рядом провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкины (IL-1, -2, -6), интерфероны (ИФН-γ), факторы некроза опухоли (TNF-α) и др., секреция которых стимулируется цитотоксическими лимфоцитами.

Таким образом, вероятно, что воспаление любой природы может способствовать Fas-R-зависимому повреждению печени. Более того, цитокины стимулируют увеличение количества молекул Fas-L на Т- и NK-лимфоцитах. Основным механизмом инициации как физиологического, так и патологического апоптоза клеток печени считают последовательный процесс связывания Fas- R, олигомеризацию комплекса и активацию адапторного белка FADD, что вызывает активацию каспазы-8. На этом этапе дальнейшее развитие апоптоза может быть заблокировано активацией ряда факторов, таких как I-FLICE (эндогенная доминантно-негативная форма каспазы-8), bcl-2 и др.[24, 40, 83] (см. главу 4).

174

Интересные данные были получены в работе, в которой культуру крысиных гепатоцитов подвергали воздействию активированных интерлейкином-2 NK-клеток и экспериментальных ингибиторов каспаз. Подавление активности каспаз предотвращало апоптоз гепатоцитов, но при этом усиливалась их гибель посредством некроза, что указывает на определенный баланс между этими путями элиминации клеток, осуществляемыми иммунной системой [24, 84].

Еще одним индуктором апоптоза и общим медиатором цитотоксичности Т-лимфоцитов и эндотоксинов в клетках печени является TNF-γ. Показана интенсивная экспрессия внутриклеточного домена его рецептора, TNF-R1, в гепатоцитах и купферовских клетках, при гепатите любой этиологии (вирусный, алкогольный, аутоиммунный и др.) [85]. Апоптоз, индуцированный связыванием TNF-γ с TNF-R1, подобно взаимодействию Fas-R - Fas-L, требует олигомеризации рецептора и может осуществляться через путь FADD - каспаза-8, а также сходный с ним белок TRADD (см главу 4). Интересно, что гиперэкспрессия TRADD ведет не только к запуску процессов апоптоза, но и к активации ядерного фактора NFкВ, который предотвращает TNF-индуцированную гибель клетки [62, 86]. Отмечают, что даже в здоровой печени NK- и CD8+-T-лимфoциты печеночных синусоидов содержат больше мРНК IL-15, -18, TNF-α, ИФН-γ по сравнению с периферическими клетками, что свидетельствует о повышенной готовности к осуществлению апоптоза гепатоцитов в случае возникновения их изменений,

например, при инфицировании вирусом [8].

5.3. Хемокины, молекулы адгезии и окислительный стресс при воспалительном повреждении печени.

Cущественная роль в повреждении печеночных клеток принадлежит воспалительным процессам, сопровождающим многие заболевания печени, такие, как алкогольный и токсический гепатиты, ишемическое/реперфузионное повреждения, сепсис и др. При этом макрофаги и нейтрофилы транспортируются в систему кровеносных сосудов печени, что сопряжено с развитием локальных повреждений ткани из-за постоянного воздействия медиаторов воспаления (таких, как TNF-α, интерлейкины, факторы комплемента, PAF и др.), влияющих на регуляцию β2-интегринов нейтрофилов [88] и генерацию гепатоцитами различных хемокинов (СХС, СС, С и др.) [89]. Хемокины - низкомолекулярные белки, регуляторы воспаления, хемотаксиса лейкоцитов и дифференцировки иммунных клеток [90]. Хемокины и их

175

рецепторы являются важными регуляторами иммунитета, особенно при миграции и локализации циркулирующих лейкоцитов. Установлено, что практически при любых патологиях печени наблюдается гиперэкспессия различных видов этих белков в зависимости от определенного подкласса лейкоцитов. Высокий уровень хемокинов определен в тканях и сыворотке крови больных алкогольным гепатитом, алкогольным циррозом и вирусными гепатитами [91]. На ранних стадиях алкогольного поражения печени доминируют СХС или α-хемокины в сочетании с нейтрофилами, на более поздней стадии возрастает уровень СС или β-хемокинов [92, 93]. Так, Biosvert с соавт. [94] показали, что на конечной стадии HCV-инфекции в гомогенатах печени присутствовали инфильтрированные лимфоциты, на которых были обнаружены в основном рецепторы хемокинов CCR5, CXCR3 и CXCR6. Предполагают, что эти воспалительные хемокины контролируют инфильтрацию Т-клеток, В-клеток и NK-клеток в пораженную печень [94].

Известно, что нейтрофилы в печени аккумулируются в синусоидах, адгезируя к эндотелиальным клеткам сосудов; показана высокая цитотоксичность таких нейтрофилов, связанная с их способностью в ответ на хемотактический сигнал мигрировать в межсинусоидальную (subsinusoidal) область, вызывая повреждение ткани. Цитотоксичность нейтрофилов по отношению к гепатоцитам осуществляется с участием специфических молекул адгезии (ICAM, VCAM, E-селектина и др.) [95], которые влияют на отдельные этапы адгезии и трансмиграции нейтрофилов. [96]. При

этом различным типам печеночных клеток свойственна разная экспрессия клеточно-адгезивных молекул (САМ's) и разный характер индукции цитокинов [95]. Так, для синусоидальных эндотелиальных клеток активация нейтрофилов при трансмиграции сопряжена с экспрессией Е-селектина. В клетках постсинусоидальных венул движение и адгезия нейтрофилов зависят от Р- или L-селектина и ICAM-1.

Для лейкоцитов важную роль в повреждениях, индуцированных нейтрофилами, играют соединения семейства β2- (СD18)-интегринов, а для гепатоцитов трансмиграция и адгезия нейтрофилов происходит с участием цитокинов LFA-1 (CD11a/CD18) и Mac-1 (CD11b/CD18). Нарушение регуляции этих цитокинов, в частности, увеличение содержания Mac-1, способствует повышению адгезии нейтрофилов к клеткаммишеням через этот триггер, а, следовательно, и повышению их цитотоксичности [95].

Механизмы гепатотоксичности нейтрофилов до конца не

176

выяснены. Полагают, что они могут быть связаны с действием протеаз (например, сериновой протеазы 4) [97] или образованием АФК. Так, показано, что генерируемые нейтрофилами АФК, могут вызывать окислительный стресс в гепатоцитах, "запуская" некроз клеток менее, чем за 1 час [98]. Механизм повреждений может включать увеличение мембранной проницаемости, открытие транзитных пор и разрыв митохондриальной мембраны (см. главу 4) [99]. Кроме того, продуцированные нейтрофилами АФК способствуют развитию воспаления в печени через активацию транскрипционного ядерного фактора NFκB, контролирующего образование цитокинов, хемокинов и молекул адгезии [88, 95].

Цитотоксическая роль нейтрофилов отчетливо выражена при алкогольных гепатитах, когда апоптозные гепатоциты оказываются солокализованными с нейтрофилами, что коррелирует со степенью выраженности тканевого поражения [100]. В связи с этим исследователи полагают, что, экстравазация нейтрофилов и апоптоз гепатоцитов являются ключевыми процессами в алкогольном поражении печени.

Купферовские клетки играют важную роль в повреждении печени. Они вместе с нейтрофилами активируются при различных патофизиологических состояниях организма. Хорошей моделью для изучения взаимодействия этих типов клеток является септическое повреждение, при котором отмечают следующую последовательность событий: (1) повышение концентрации поступившего через воротную вену эндотоксина; (2) активация купферовских клеток и высвобождение из них провоспалительных

медиаторов, таких как хемокины, цитокины, включая интерлейкины, лейкотриен В4 и др.; (3) выход нейтрофилов из кровяного русла; (4) присоединение активированных нейтрофилов к синусоидальным эндотелиальным клеткам; при этом молекулы адгезии ICAM-1 и ЕСАМ-1 способствуют миграции лейкоцитов в паренхиму печени; (5) генерация активированными нейтрофилами АФК, вызывающих повреждения разного типа, в том числе активацию перекисного окисления в мембранах; (6) продуцирование макрофагами печени различных токсических медиаторов, вызывающих агрегацию тромбоцитов, что приводит к микротромбозам; (7) появление в узких синусоидах тромбов (агрегатов из нейтрофилов и тромбоцитов) и развитие локальной гипоксии; (8) появление лобулярных некротических поражений [101].

В целом, цитотоксичность ряда гуморальных факторов связана с особенностями синусоидальных эндотелиальных клеток, которые, в отличие от клеток других видов эндотелия, фенестрированы и не имеют базальной мембраны.

177

При некоторых поражениях печени (венозно-окклюзионные заболевания, лекарственные поражения) повреждение синусоидальных эндотелиальных клеток является начальным этапом иммунной реакции, опосредованной Т-лимфоцитами. Сужение малых внутрипеченочных вен с развитием микротромбозов ведет к нарушению оттока крови и развитию ишемии печени с вторичным повреждением гепатоцитов.

Таким образом, воспалительные процессы, сопровождающие многие заболевания печени, через активацию лимфоцитов, нейтрофилов, естественных киллеров и стимуляцию синтеза соответствующих медиаторов (цитокинов, хемокинов) усугубляют повреждения клеток печени, вызванные первоначально вирусами, эндоили экзотоксинами. Эти повреждения могут приводить к некрозу клеток печени, особенно если в них вовлечены активированные нейтрофилы, влиянию которых на гепатоциты способствуют молекулы адгезии. Поэтому терапия, направленная на коррекцию иммунной системы, может оказать выраженное действие при заболеваниях печени, снижая клеточные повреждения и предотвращая некроз гепатоцитов.

5.4. Гепатотоксичность, вызываемая дисфункцией митохондрий.

Среди различных форм повреждений печени определенное место занимают микровезикулярный стеатоз (жировая дисфункция), неалкогольный стеатогепатит и цитолитический гепатит [102, 103]. Эти повреждения связаны с первичными и вторичными

дисфункциями митохондрий. Нарушение митохондриального β- окисления ЖК в гепатоцитах вызывает микровезикулярный стеатоз, характеризующийся накоплением в цитоплазме мельчайших липидных везикул триглицеридов. Последние образуются вследствие накопления (из-за дефицита окисления) свободных ЖК, которые, с одной стороны, этерифицируются в триглицериды, а с другой, - обладая детергентными свойствами, способствуют эмульгированию образующихся неполярных триглицеридов, "окружая" их и собирая в мелкие липидные везикулы.

Микровезикулярный стеатоз является гистологическим маркером выраженных метаболических нарушений, связанных с ослаблением синтеза АТФ митохондриями. Итогом дефицита энергетических субстратов может быть почечное воспаление, панкреатит, кома и смерть. Этому может способствовать и сопутствующее развитие неалкогольного стеатогепатита, сопровождающегося, помимо названных нарушений, активацией ПОЛ [104].

Резкое повышение проницаемости внутренней мембраны

178

митохондрий для электролитов и низкомолекулярных молекул обычно сочетается с клеточным некрозом, независимо от внутренней концентрации АТФ. Неспецифическое повреждение внутренней митохондриальной мембраны чаще всего вызывается активацией ПОЛ или действием фосфолипаз (см. главу 4).

Митохондриальные цитопатии часто связаны с гепатотоксичностью ряда лекарств, таких, как антибиотики тетрациклинового ряда (доксициклин, хлортетрациклин, метациклин), аналоги нуклеозидов, применяемые для лечения вирусных инфекций (диданозин, зальцитабин, зидовудин, вальпроат натрия). Механизм данного типа лекарственного поражения печени обусловлен, в основном, токсическим действием лекарственного препарата на митохондрии, а точнее - блокадой ферментов дыхательной цепи. Непосредственный механизм подавления ферментов дыхательной цепи у перечисленных выше препаратов различен: от прямого подавления (2-пропилпентаноевой кислотой, метаболитом вальпроата натрия) до опосредованного (противовирусные аналоги нуклеозидов).

5.5. Токсические повреждения печени.

Основные формы токсического повреждения печени могут быть острыми и хроническими. Они проявляются цитотоксическим и холестатическим эффектами. Клиникоморфологические проявления токсических поражений печени весьма многообразны и подробно описаны в литературе [2, 10 - 12, 101, 105 и др.]. Цитолитические повреждения, как правило,

сопровождаются стеатозом и некрозом гепатоцитов, а холестатические - гепатоканаликулярной или каналикулярной желтухой. Хронические формы поражения печени проявляются хроническим активным гепатитом, стеатозом, фосфолипидозом, циррозом, вено-акклюзионным состоянием, опухолями и т.д.

Токсические, в том числе лекарственные, повреждения печени составляют около 5% всех ее воспалительных поражений, но занимают лидирующие позиции среди причин острой недостаточности печени. Сегодня доказана способность повреждать печень у более чем трехсот медикаментов и нескольких миллионов химических соединений. Все ксенобиотики, вызывающие поражение печени, условно подразделяют на облигатные и факультативные. Первые способны повреждать паренхиму печени в стандартных дозах; увеличение дозы сопровождается повышением токсичности. К таким соединениям относятся четыреххлористый углерод, препараты фосфора, хлороформ, мускарин и др. К облигатным гепатотоксинам относятся также соединения, не

179

обладающие прямым токсическим действием на печень, но способные: (1) вызывать гепатомегалию за счет индукции печеночных ферментов (фенобарбитал); (2) вызывать стеатоз или жировую инфильтрацию печени (кортизон); (3) трансформироваться в процессе метаболизма в промежуточные соединения, обладающие высокой токсичностью (например, салицилаты, полициклические углеводороды и др. [106]).

Действие на печень факультативных соединений независимо от дозы вызывает иммуноопосредованные реакции, которые лежат в основе идиосинкразии (некоторые исследователи считают это аллергической реакцией на лекарства или химические соединения). К лекарственным представителям этой группы относят такие известные соединения, как фторотан, метилдофа, допегит, аминазин, тетрациклин, эритромицин, флуклоксациллин, триметоприм (компонент бисептола), противотуберкулезные средства (изониазид, особенно в сочетании с рифампицином) и др. Начальным этапом идиосинкразии как формы лекарственного поражения печени на уровне гепатоцита является связь лекарственных веществ или их компонентов с мембраной. Далее мембранные белки (в т.ч., цитохром Р450), модифицированные под действием этих соединений, воспринимаются организмом в качестве антигена, запускающего иммунный ответ. Отмечено, что подобные поражения печени развиваются у лиц с повышенной чувствительностью, в том числе обусловленной генетически.

В случае идиосинкразии, отмечают несколько основных механизмов повреждения клеток печени иммуноопосредованными

реакциями: (1) активация цитолитических лимфоцитов и NK-

клеток, образование клеточных ассоциаций (например, адгезия

нейтрофилов к синусоидальным эндотелиальным клеткам, агрегация тромбоцитов и др.); (2) образование неоантигенов и аутоантител (например, образование новых антигенных детерминант при окислительном повреждении белков, что может

инициировать образование циркулирующих антител); (3) действие

медиаторов (цитокины, хемокины, оксид азота); (4) активация системы комплемента.

Метаболизм ксенобиотиков в печени можно условно разделить на три фазы:

1.Метаболизм соединений с участием ферментов ЭР

(микросомальной фракции гепатоцитов), монооксигеназ, цитохром

ñ-редуктазы и цитохрома Р450, а также восстановленного НАДФ в качестве кофактора.

2.Биотрансформация ксенобиотиков или их метаболитов, которая заключается в конъюгации соединений с эндогенными молекулами. Процессы конъюгации катализируют чаще всего

180